眼睑皮肤恶性黑色素瘤早期检测进展

1、眼睑皮肤恶性黑色素瘤早期检测进展    【摘要】 眼睑皮肤恶黑瘤发病率低，预后差，在临床及病理上很难与其他肿瘤鉴别。本文回顾了国内外眼睑皮肤恶黑瘤相关基因、肿瘤标志物的文献，发现B-RAF、hTERT、NOS及melan-A均与眼睑皮肤恶性黑色素瘤发生、发展，早期检测相关，有利其鉴别诊断。    【关键词】 眼睑恶性黑色素瘤基因早期检测 The advances on early detection of eyelid malignant melanoma    Abstra

2、ct Eyelid malignant melanoma is rare but has a grave prognosis. It is very difficult to differentiate eyelid malignant melanoma and other tumors in clinical and pathological. Studies on the correlated genes, tumor markers in eyelid malignant melanomas are reviewed in the present paper. The results s

3、how B-RAF, hTERT, NOS and melan-A contributed to the eyelid malignant melanomas in onset, progress and early detection which are advantageous for differential diagnosis.    ? KEYWORDS: eyelid; malignant melanoma; gene; early detection 0引言    眼睑皮肤恶黑瘤占眼睑肿瘤不到1%，占

4、眼睑恶性肿瘤5.4%，发生率在我国居眼睑恶性肿瘤第4位，近年呈增加趋势。目前眼睑皮肤恶黑瘤的诊断即肿瘤病理活检及黑素细胞抗体HMB45，S-100蛋白免疫组化分析。近年肿瘤研究不断深入，更多肿瘤标志物、相关基因开始用在眼睑皮肤恶黑瘤的早期检测中。    1 B-RAF与眼睑皮肤恶黑瘤    Raf是一类进化保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是Raf-Ras-MEK-ERK-MAPK(MEK: mitogen/extracecullar signal-regulated kinase; ERK: extracecullar

5、signal-regulated kinase; MAPK: mitogen-activated protein kinase)信号转导途径中的重要成员，在细胞增殖、分化、生长、及凋亡中起重要的调控作用。B-RAF原癌基因又名鼠类肉瘤滤过性毒菌（V-Raf）致癌同源体B1，受其上游RAS蛋白激酶的调控，为脊椎动物细胞中Raf家族成员，它可通过其mRNA的不同剪接产生大小不同的分子，行使不同功能。通过对肿瘤细胞株基因组DNA突变筛选后证明B-RAF原癌基因在60%以上的恶性黑色素瘤及少数的肠癌、甲状腺癌、肺癌、卵巢癌等多种肿瘤中都有突变1。曾有试验将突变的B-RAF基因转染到黑色素细胞中，使其表

6、型发生恶性转变，将该细胞株接种到裸鼠体内，发现其呈侵袭性生长，并导致肿瘤形成2。所有的B-RAF原癌基因突变都限定于激酶结构域内，主要突变发生在15（89%）外显子上，其中约92%位于第1799核苷酸上，导致其编码的谷氨酸被缬氨酸取代（V600E），此种错义突变使B-RAF激酶活性发生改变，持续激活ERK、MEK和MAPK通道，使前有丝分裂原有效分裂能力增强，导致细胞异常增殖和分化，从而形成肿瘤。ERK被激活后活性增加，促进细胞增殖和侵袭、改变整合素的表达、降低E-钙黏素表达及增加基质金属蛋白酶（MMP）分泌3。采用特异性MEK激酶抑制剂阻断B-RAF突变引起的下游信号通路的激活，如口腔内给药

7、CI1040就能有效抑制鼠的恶黑瘤肺转移，并能使已产生的肺转移灶缩小甚至消失4。而 MAPK通路的激活被认为是促进细胞非控制性的分裂，它通过传递胞外分裂信号在黑色素瘤细胞增殖过程中扮演重要角色。MAPK信号传递抑制剂如LeTx（炭疽致死毒素)及小分子MAPK激酶抑制剂均能触发人黑色素瘤细胞凋亡2。    有学者通过研究spitzoid黑色素病变中B-RAF, N-RAS, 和 H-RAS 3种基因的表达，发现spitzoid恶黑瘤及其转移癌中均有86%发生B-RAF或N-RAS变异，疑为恶黑瘤的色素性病变中35%存在B-RAF或N-RAS的变异，Spit

8、z痣和非典型Spitz痣中均未发现3种基因的变异。Spitz痣和非典型Spitz痣及疑为肿瘤的病变中测到H-RAS变异率各为29%、14%及7%，spitzoid恶黑瘤中表达阴性。因此提示鉴别诊断良恶性spitzoid黑色素病变中B-RAF及相关基因变异分析可作为辅助诊断工具5。而Uribe等6认为B-RAF变异在良性和非典型黑素细胞痣及恶黑瘤三者中的表达并无统计学意义，且其变异情况与恶黑瘤Clark's分级无关。现有资料表明B-RAF突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关，可能是一种新的恶性肿瘤相关基因，新的基因治疗靶点。但对B-RAF突变的研究只有短时间几年研究，尚缺乏大规模

9、、系统而深入的研究，仍有较多有争议的问题需进一步阐明。    2人端粒酶逆转录酶（hTERT）与眼睑皮肤恶黑瘤    端粒是位于真核细胞染色体末端，由串联排列的重复DNA序列和端粒结合蛋白构成的特殊结构，在染色体复制及保护染色体稳定中起重要作用。正常人类体细胞每分裂一次丢失50200bp，端粒缩短到一定程度后，细胞就会衰老死亡。端粒酶为一具有逆转录酶活性的核糖核蛋白体，以自身RNA组分为模板，逆转录合成端粒的重要序列，加入到缩短了的端粒中去补偿细胞分裂时染色体末端端粒的缩短，维持其原有长度使细胞“永生化” 7。对人

10、类来说，端粒酶活性出现在大多数胚胎组织，正常成年男性生殖细胞、炎性细胞、更新组织的增生细胞及大多数肿瘤细胞。端粒酶由人端粒酶RNA（hTR）, 端粒酶相关蛋白（TP1/TLP1）和人端粒酶催化亚单位/人端粒酶逆转录酶（hTRT/ hTERT）3个亚单位组成。到现在为止，hTERT在大部分恶性肿瘤中表达，在正常组织（除生殖细胞和有高度复制潜能的体细胞）中不表达。而其他两种成分在肿瘤组织和正常组织中均有不同程度的表达8。曾有试验研究hTR及hTERT各自在乳腺癌、甲状腺癌及恶黑瘤中的表达，表明只有hTERT可作为肿瘤患者血浆中一非特异性肿瘤标志物9。    

11、据报道端粒酶在消化、泌尿、血液、呼吸等系统肿瘤细胞中表达均呈阳性，从良性痣到非典型痣再到恶黑瘤及转移性恶黑瘤其活性持续增高，活性高低与肿瘤分化程度，临床分期密切相关10，且与hTERT阳性表达显著正相关，受hTERT转录和选择剪接的调节控制 11。现认为端粒酶可用于肿瘤筛查，判定肿瘤恶性程度及患者预后7 ，hTERT的检测可作为端粒酶活性研究指标12。国内研究显示hTERT阳性表达随黑素细胞良恶性变化而逐渐增加，hTERT阳性细胞也见于良性黑素细胞，说明端粒酶激活只代表细胞增生活跃或获得一定程度永生化能力，但不是恶性肿瘤特有，当该酶激活能力很高达一定阈值，细胞才获得永生化能力发展为恶性肿瘤13

12、。各种痣中hTERT阳性细胞可能已具有进一步演变为恶黑瘤的潜能，追踪hTERT阳性痣病变患者将有助于早期发现恶黑瘤，提示对hTERT检测在恶黑瘤早期检测方面具有良好临床应用前景14。但有报道hTERT仍不能作为原发黑色素病变的辅助组织学诊断，其原因尚不清楚15。    3一氧化氮合酶NOS与眼睑皮肤恶黑瘤    一氧化氮NO主要在体内参与血管舒张、神经递质转导、巨噬细胞介导细胞毒等多功能调节，介导DNA损伤参与早期肿瘤形成过程，通过刺激肿瘤细胞侵袭性，诱导血管生成，调节免疫系统而促进肿瘤的生长、侵袭和转移。它由一氧

13、化氮合酶NOS家族合成，包括神经型NOS(nNOS ),内皮型NOS（eNOS）和诱导型NOS（iNOS）。前两者主要分布在神经组织和血管内皮，产生短时效、少量NO，作为神经递质和调节局部血流。后者主要由巨噬细胞产生，产生长时效、大量NO，具有多种不同功能。    目前研究较为深入的是iNOS，正常情况下机体不合成有活性的iNOS，病理过程如炎症反应、肿瘤和自身免疫反应等情况下，巨噬细胞可活化产生iNOS，释放大量NO从而杀伤肿瘤细胞和病原微生物，同时NO又是一种自由基，可直接或通过分解成许多小分子毒性物质损伤细胞。大量研究表明iNOS在神经细胞瘤、胃癌

14、、肝癌、结肠腺癌、乳腺癌等都有较高的表达，并作为双刃剑在不同情况下发挥促进肿瘤生长、抑制和杀伤肿瘤的作用16。iNOS在色素痣中无表达，在恶黑瘤中却频繁表达，特别是转移型，推测iNOS在黑素细胞恶变，肿瘤生长中扮演重要角色，可能是一有效恶性黑色素病变的免疫组化指标17，且其阳性表达率与患者生存时间反比，因此可将其作为评价恶黑瘤转移，侵袭及预后的指标之一18。而 eNOS及nNOS的水平和（或）活性在恶黑瘤中有较色素痣和正常黑素细胞高的表达，推测由此种酶产生的NO可能具有舒张恶黑瘤血管，促进其生长，转移的功能19.20。最近研究发现黑素瘤细胞和色素痣细胞中iNOS和eNOS阳性表达率无显著统计学

15、差异，转移与无转移的标本中结论相反，表明两者在促进恶黑瘤生长和肿瘤血管生成中起一定作用，可考虑作为恶黑瘤是否转移的指标之一。而黑素瘤细胞和色素痣细胞中nNOS阳性表达率具显著统计学差异，在转移与无转移的标本中结论相反。因此nNOS可考虑作为恶黑瘤与色素痣鉴别的指标21。但这仅是推测，无直接证据。目前国内外对于iNOS释放的NO对恶黑瘤细胞的凋亡及转移作用问题上仍有很大争议，需进一步研究NOS在恶黑瘤中的作用机制。    4 Melan-A检测与眼睑皮肤恶黑瘤    Melan-A蛋白是MART（melanoma a

16、ntigen recognized by T cells）-1基因的一种产物，常用抗体A103检测，近年被认为是一种辨别黑色素病变的有效抗原。采用免疫组化使用单克隆抗体A103评估原发皮肤恶黑瘤中melan-A表达情况及其与肿瘤分期和生存率的关系，发现melan-A不仅是原发皮肤恶黑瘤的特异性诊断标志物，且有助于改善恶黑瘤患者预后22。现有专家提出3种免疫标志物单克隆抗体最佳浓度联合溶液，即MART1(M2-7C10)、melan-A(A103)和Tyrosinase(酪氨酸酶T311)，被称为“MCW”黑素瘤鸡尾酒，在判定恶黑瘤的微小转移病灶中具较高检测率23。  

17、60; 由于眼睑皮肤恶黑瘤形态复杂，临床上对其组织病理诊断仍存在一定问题，因此免疫组化检测在其确诊过程中起重要作用。常用免疫组化标志物即黑素细胞抗体HMB45 ，能识别前黑素小体球蛋白，仅对恶黑瘤和向恶黑瘤分化的其他肿瘤呈阳性表达，多数学者认为HMB45对恶黑瘤有高度特异性，视为恶黑瘤首选抗体。随着免疫组化的广泛开展，在血管平滑肌脂肪瘤、透明细胞瘤、间质细胞肿瘤中HMB45也能表达24。其次S100蛋白，主要存在于神经组织及其肿瘤和恶黑瘤中，其敏感性特别强，无论原发瘤或转移瘤，标记百分率均为100，且与恶黑瘤的分化程度与组织学类型无关，因而对其标记为阴性的恶性肿瘤可作出排除恶黑瘤的诊

18、断。Heegaard S25曾比较melan-A、S100、HMB45分别在结膜、虹膜、睫状体及脉络膜恶黑瘤中的表达，结果显示melan-A在结膜及虹膜恶黑瘤中敏感度较HMB45 高，在脉络膜恶黑瘤中两者相似。虹膜恶黑瘤中melan-A染色特异性较S100高，提示melan-A可能成为检测眼球恶性黑色素病变的一辅助标志。其他专家通过免疫组化半定量研究提示melan-A可鉴别非色素性肿瘤和原发，转移性黑色素瘤，敏感度、特异性强于HMB45，但在检测梭形细胞及结缔组织增生性黑色素瘤时其价值仍不及S10026,27。    5展望与问题  

19、  因眼睑皮肤恶黑瘤发展迅速，易广泛转移，恶性度高，治疗棘手。早期诊断，及时正确治疗非常重要，建议对于疑似恶黑瘤的眼睑病变均应早期行活组织病检，但因眼睑皮肤恶黑瘤组织结构，细胞形态变化多样，凭临床及病理特征诊断仍有一定困难，因此对其应用更多的组织病理技术，如B-RAF变态分析、运用TRAP或PCR测定hTERT、免疫组化分析NOS及melan-A在组织中的表达，对眼睑皮肤恶黑瘤的鉴别会发挥重要作用。但对此肿瘤研究时间尚短，许多问题上存在争议，因此还需进一步行更深入，广泛的研究试验。 【参考文献】 1尹香利,张国昌. BRAF原癌基因与甲状腺癌关系的研究进展.陕西医学杂志,2

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