早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响

1、早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响         10-04-22 13:20:00     作者：李晓捷， 吴琼    编辑：studa20【摘要】  目的 研究早期干预对宫内感染致脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞原位增殖能力的影响。方法 30只孕17 d大鼠连续2 d腹腔注射脂多糖(450 g/kg)，设为脂多糖组,制备宫内感染脑损伤动物模型，生理盐水组6只注射等量生理盐水。将脂多糖组所产足月新生仔鼠用

2、随机数字表法分为损伤组和训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各30只。对训练组进行早期干预至日龄28 d,对照组、损伤组常规饲养;选取1，3，7，14，28 d各组仔鼠用免疫组织化学方法动态检测海马齿状回颗粒层，BrdU阳性细胞的表达。结果 (1)出生后1 d对照组、训练组、损伤组新生大鼠海马齿状回颗粒层均存在BrdU，对照组显著高于训练组、损伤组(P<0.01)。(2)对照组BrdU阳性细胞数3 d开始增加，7 d达到高峰，14 d后下降，28 d接近正常成年大鼠水平。(3)早期丰富环境刺激后，训练组大鼠海马齿状回颗粒层BrdU阳性细胞数在3 d开始增加，14 d达高峰，峰值显著高

3、于对照组水平(P<0.01)，28 d后下降，但仍高于对照组，BrdU阳性细胞数在时间上均呈一过性增高表达。结论 宫内感染致大鼠脑损伤可导致内源性神经干细胞增殖能力降低，并较长时间内难以自然恢复;早期干预可激活脑损伤鼠内源性神经干细胞原位增殖能力，推迟高峰出现，延长作用“时间窗”。 【关键词】  脑损伤; 宫内感染; 神经胶质增生; 干预; 大鼠; 动物，实验【Abstract】 Objective To study the impact of early intervention on proliferation of neural stem cells in brain d

4、amage rats after intrauterine infection.Methods Totally 36 Wistar pregnant rats were randomly divided into two groups:LPS(n=30) and saline(n=6).Pregnant rats were consecutively injected with LPS(450 g/kg) or saline on gestation 17 d.Saline neonatal rats were randomly selected as saline group N(n=30)

5、,LPS neonatal rat as training group T(n=30) and injury group I(n=30).The 1 d T group rats were interfered by early interventiont.At the same time,the N,I group rats were fed in the routine way.The expression of bromodeoxyuridind(BrdU) were determined by immunohistochemistry at 1，7，14，28 d of all gro

6、ups.BrdU was used to mark dividing neural stem cells(NSCs) in hippocamp dentate gyrus subgranular zone(SGZ).Results (1)BrdUlabeled cells could be observed in all groups;I groups and T groups were markedly less than N group(P<0.01).(2)The number of positive cells of N group increased at 3 day(P<

7、;0.05),approximately six fold with a peak at 7 day,markedly decreased at 28 day and approched normal level of mature rats.(3)Compared with the N group,the number of positive cells of T group increased strikingly at 3 day(P<0.01),exceeding N group and approximately six fold with a peak at 14 day,t

8、hen gradually decreased,but still higher than N group at 28 day.The appearance of increasing peak in T group was lengthened，value ascended.Conclusions Our results indicate that the brain damage caused by intrauterine infection can lead to the decrease of proliferation of inherent NSCs.The damage wil

9、l not recover itself.Early intervention can stimulate the proliferation of inherent NSCs.Early period enriched environment can prolong the development window phase of inherent NSCs.【Key words】 Brain damage; Intrauterine infection; Glial proliferation; Intervention; Rat; Animal，experiment神经干细胞(neural

10、 stem cells,NSCs)在一定病理条件和干预作用下可以增殖、分化成神经元和神经胶质细胞，参与修复缺损的神经功能1。脑性瘫痪(简称脑瘫)是指出生前到出生后发育时期非进行性脑损伤所致综合征，是继小儿麻痹后儿童肢体严重残疾的主要疾病之一，孕期感染所致的脑损伤是脑瘫的高危因素2。因此,探讨宫内感染致脑损伤的发生机制，控制病情发展已经成为当前研究中的重点。本研究旨在观察早期干预对宫内感染致脑损伤后内源性NSCs的反应过程，为脑损伤后机体自我修复提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验动物与试剂 清洁级成熟Wistar大鼠60只，雌性40只，雄性20只，体质量180240 g，由佳木斯大学实验动

11、物中心提供。脂多糖(脂多糖血清型055：B5，美国SIGMA公司)。5BrdU免疫组织化学试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)。1.2 动物模型制备与分组 运用李晓捷等3所建的宫内感染致脑损伤动物模型，将研究对象常规饲养,饮食自由,明暗周期12 h/12 h,室温(18±3)。于下午17时以21合笼,次日上午8时查阴道涂片,查到精子记为妊娠0 d,孕鼠另笼饲养。随机数字表法选取孕鼠分为脂多糖组30只和生理盐水组6只。脂多糖组孕17 d大鼠连续2 d腹腔注射脂多糖,剂量为每次450 g/kg;生理盐水组大鼠腹腔注射等量生理盐水。观察两组大鼠的分娩时间,孕22 d前分娩的仔鼠为早产鼠,去

12、除早产鼠。仔鼠出生后，取胎盘做苏木精伊红染色观察宫内感染情况。将脂多糖组所产足月新生仔鼠用随机数字表法分为损伤组、训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各30只。设生后1，3，7，14，28 d 5个时间点，每个时间点6只，测定BrdU水平变化，进一步分析探讨早期干预对脑损伤内源性NSCs增殖能力的影响机制。1.3 早期干预方法对照组和损伤组分别饲养于20 cm×30 cm×45 cm标准笼内，不予早期干预。1.4 BrdU标记和染色1.5 BrdU免疫组织化学结果判定 光镜(10×20)下以细胞核内有棕褐色或棕黄色颗粒且密度不均者为BrdU阳性细胞，观察阳性细

13、胞在脑内分布情况;在显微镜400倍视野下计数阳性细胞,共计数5个视野,取其平均值。计算机图像分析系统软件(Image macro 4.0)计数脑损伤后不同时间段海马齿状回颗粒层阳性细胞。1.6 统计学方法 实验数据以±s表示。采用SPSS 13.0统计软件进行统计。两样本均数两两比较采用LSDt检验，多样本均数两两比较采用q检验。检验水准取=0.05。2 结果2.1 各组BrdU阳性细胞数变化结果 BrdU定位于细胞核，为棕色颗粒状，标记的是全部的新生细胞，训练组、损伤组、对照组大鼠海马齿状回颗粒层周边均存在BrdU阳性细胞，对照组出生1 d大鼠的数量较多，排列较为规律，显著高于损伤组及训练组(P<0.01);损伤组及训练组BrdU阳性细胞数量稀少，无明显差异。见图1。2.2 对照组BrdU阳性细胞数各时间点变化结果 对照组BrdU阳性细胞数在出生3 d开始增加，7 d达到高峰，14 d后下降，28 d接近正常成年大鼠水平。见表1。2.3 早期干预