心血管蛋白芯片在急性冠脉综合征中的研究进展

1、心血管蛋白芯片在急性冠脉综合征中的研究进展 【关键词】 心血管蛋白芯片；急性冠脉综合征；蛋白标志物急性冠脉综合征（ACS）为冠心病急症，其范围涵盖了从不稳定型心绞痛（UA）、急性非ST段抬高的心肌梗死到ST段抬高的急性心肌梗死(AMI)等一系列临床病理生理状态。其共同的病理基础是不稳定粥样斑块破裂伴随着血小板的黏附、激活及聚集、血栓形成，从而导致急性、亚急性心肌缺血。研究表明炎症与免疫因素在动脉粥样硬化(AS)及其并发症中起着重要作用1。现已证实，C反应蛋白(CRP)，细胞因子如TNF、IL1、IL2、IL6、IL8等，CD40L，金属蛋白酶等参与并调节动脉粥样硬化（AS）斑块内血管内皮细胞、

2、血管平滑肌细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞等发生的炎症反应过程。而ACS病人急性心肌损伤坏死的蛋白标志物如肌钙蛋白（cTnI）、心肌型脂肪酸结合蛋白（HFABP）也证实对AMI的诊断、危险分层、预后判断有着重要的价值。早期发现这些与ACS发病机制密切相关的蛋白标志物将有助于ACS的诊断、治疗及危险分层。1 传统方法研究ACS患者单蛋白标志物的现状与进展 传统的单蛋白研究方法（如酶联免疫吸附法）作为诊断和治疗的临床依据之一，可用来检测病人血清或血浆中某一种或几种蛋白标志物的含量，探讨疾病的发病机制及转归。对ACS患者循环中的炎性及炎性相关因子，心肌损伤蛋白标志物的单蛋白研究已日趋成熟。1.1 炎性蛋白

3、标志物在ACS中的研究现状细胞因子是由机体免疫细胞和非免疫细胞合成、分泌的，调节细胞生理功能的小分子多肽，具有高效性、多向性及内生性的特点。ACS中粥样斑块局部的炎症细胞产生和释放细胞因子，后者可激活内皮细胞、改变其天然的抗黏附和抗凝固性质。同时，细胞因子能降低基质合成作用，并增加其退行性病变，有利于斑块破裂。此外，细胞因子能增加内皮细胞和巨噬细胞的合成作用，导致平滑肌细胞对局部血管收缩因子的反应性增强。参与AS炎症过程中的细胞因子主要有IL6、IL8、TNF和IL1等。TNF和IL1都能激活溶胶原酶系基质金属蛋白酶（MMPs），导致基质降解2。IL6的产生不仅与炎症反应有关，还具有促凝血功能

4、及刺激平滑肌增殖和诱导肝细胞产生大量CRP1。Balbay等3检测了34名稳定型心绞痛(SAP)患者、15例AMI患者和20例对照组患者血清IL1水平，发现AMI和SAP组较对照组明显增高(P0.001)。Romuk等4研究CHD患者的血浆IL8水平变化，结果显示，UA患者的血IL8水平明显高于SAP患者(P0.01)和对照组(P0.02)，提示IL8在一定程度上反映冠状动脉斑块的稳定性。1.2 炎性相关的细胞因子在ACS的研究进展1.2.1 MMPsMMPs是一类结构中含有Zn2+和Ca2+，由巨噬细胞、血管平滑肌细胞、内皮细胞等产生、可消化细胞外基资的重要蛋白酶类。近年来人们认为MMPs是

5、造成冠状动脉粥样斑块不稳定的重要因素之一，可以通过消化纤维帽成分降低其强度，从而加速斑块的破裂。正常血管壁内皮细胞不能分泌MMPs，AS发生时，局部缺氧、氧化低密度脂蛋白、瘦素可诱导AS斑块内表面及斑块内新生血管壁上的内皮细胞分泌MMP1、2和9。MMP1有效降解纤维胶原，MMP2和9降解基底膜，在AS斑块内皮糜烂及溃疡形成中起一定作用。Kai等应用ELISA法测定了CHD患者的血清MMP2和血浆MMP9水平，结果显示，在入院未经治疗时，UAP和AMI的MMP2水平较对照组增高2倍，MMP9水平亦分别增高3和2倍。可以认为，血MMPs水平在一定程度上反映了细胞外基质的降解，但是否能作为冠脉斑块

6、不稳定性的参考指标仍需要进一步证实。新近Inokabo5等观察了冠脉循环中MMP9和TIMP1浓度的变化，证实了在ACS中存在活动性的斑块破裂。 1.2.2 CD40LCD40L是一种跨膜蛋白，存在于激活的淋巴细胞和血小板以及动脉粥样斑块内的主要细胞成分(包括血管内皮细胞。血管平滑肌细胞、巨噬细胞等)的表面。CD40L分为可溶性及膜结合性两型。正常动脉组织及内皮细胞没有表达。最近的研究表明，CD40与CD40L的相互作用不只局限于免疫炎症细胞的相互传递，还参与斑块内主要炎症细胞的调节，对斑块的不稳定性有着重要作用。Lutgens6等研究发现他汀类药物能使高胆固醇血症病人外周血CD40和CD40

7、L的表达下调。国内李江等7研究通过ELISA法检测129例冠心病患者（其中AMI 46例，UA 37例，SAP 46例）及30名正常对照者血清sCD40L的浓度发现，AMI组与UA组显著高与SAP组和对照组，揭示了sCD40L与ACS发生相关。1.2.3sVCAM1 黏附分子是一类介导细胞以及细胞外基质黏附的糖蛋白，包括选择素家族、整合素家族、钙离子依赖黏附素家族、免疫球蛋白家族等。正常情况下，内皮细胞并不连续表达，而是通过致AS因素及其他致炎因子诱导产生。Mulvihill的研究表明，激活的内皮细胞表面表达的黏附分子释放入血，这些可溶性黏附分子的循环水平在判断AS病变活动方面具有预测性8。已

8、有研究9证实ACS组中sVCAM1和sICAM浓度显著高于稳定性冠心病组(P0.05)及对照组(P0.01)，而ACS组中AMI与UA患者之间sVCAM1和sICAM水平无差异。这一结果与宋玮等10的报道相一致。而且动物实验已证实干预sVCAM1、sICAM、P选择素的作用对心肌梗死后的组织破坏有益。应用VCAM1单克隆抗体治疗动脉损伤的动物，可部分减轻损伤，阻止血管平滑肌细胞迁移11。1.3 心肌损伤的蛋白标志物在ACS中的研究及进展1.3.1 肌钙蛋白心肌急性缺血损伤时常会有血清学指标的变化，如心肌肌钙蛋白（包括cTnI和cTnT），肌红蛋白（MYO）及磷酸肌酸激酶（CKMB）的改变。Tn

9、是肌肉组织收缩的调节蛋白，主要存在于骨骼肌和心肌中，由肌钙蛋白T（cTnT），肌钙蛋白I（cTnI），肌钙蛋白C（cTnC）三个亚单位组成。骨骼肌和心肌中的Tn结构不同，所以cTn是心肌细胞特有的成分，其血清浓度的升高是心肌损伤的特异生化标志物。1987年Commins等首先报道测定血清肌钙蛋白用于AMI的诊断。近年的临床研究证实，cTn作为早期心肌损伤标志物，其敏感性，特异性，以及持续时间较血清CKMB长，因此可作为ACS有价值的“金标准”。1.3.2 心肌型脂肪酸结合蛋白(FABP)FABP是一组小分子细胞内蛋白质，平均分子量为15 kD左右，可以从心肌细胞中迅速释放入血并从尿液中排出。F

10、ABP是新近发现的一种AMI标志蛋白。目前已鉴定出了9种不同类型的FABP，其三级结构类似，均有两个螺旋和折叠结构。HFABP因其分子量小、心肌含量高，存在于胞浆中，其特点在AMI早期(通常在发病1.5 h)就有升高，510 h达到峰值，24 h回复正常，是CAD病理过程中心肌缺血的早期生化标志物。由于UAP可能是AMI的前期表现，常有一过性心肌缺血或心肌微小损伤，HFABP具有早期敏感性，因此UAP患者HFABP浓度的增高更有意义，而且增高倍数与AMI组有差异12。与传统的心肌损伤标志物如MYO，CKMB等相比较，HFABP因其早期敏感性和特异性更高，在AMI的诊断、评价心脏手术时心肌损害程

11、度及AMI溶栓效果上有许多优势。预测HFABP可能将成为判断ACS的又一新的“金标准”。1.4 NTproBNP在ACS中的研究NTproBNP是proBNP裂解物，形成部位主要是心房和心室，是没有生物学活性的脑钠肽前体（proBNP）。以往的研究多集中于成熟BNP的生物学功能上，忽略了对没有生物学活性的脑钠肽前体（proBNP）的研究。研究认为，NTproBNP在心衰患者中升高，且随着心衰的严重程度明显升高。因此NTproBNP是发现早期心功能不全敏感的标志物13。NTproBNP升高在有缺血性心脏病患者中多见，但并不和心电图及心肌缺血的生化标志物相关，也不助于诊断急性心肌缺血。所以在疑诊A

12、CS患者，引起血浆NTproBNP升高的主要决定因素在于心功能不全而不是急性心肌缺血14。 2 应用心血管蛋白芯片技术研究ACS蛋白标志物 人类基因组计划的实施、遗传学的发展和现代分子生物学技术的突飞猛进，使人们对心血管疾病有了新的认识。除了少数单基因病外，心血管疾病中最多见的还是复杂性多基因疾病（如ACS、心力衰竭及高血压等）。面对庞杂的心血管疾病遗传信息，传统的单蛋白研究已不适用细胞、组织、微生物中单个蛋白的研究，而作为高通量、高灵敏度、高特异性且微型化的蛋白质芯片技术，在众多蛋白测定方法中脱颖而出。2.1 蛋白芯片技术的基本原理及特点蛋白芯片是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片

13、等各种载体上成为检测用的芯片，然后用标记了荧光、放射性核素、生物素等的蛋白质与芯片反应，经漂洗将未能与芯片上蛋白质结合的物质洗去，再利用荧光扫描仪、激光共聚焦显微镜等对信号进行检测，最后通过专门的计算机软件进行图像分析和结果解释。另外还可以利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术（SELDITOFMS）或串联质谱（MS/MS）对蛋白质分子量及相对含量进行分析。与传统的方法相比较具有一次样品用量少（一般在几十微升以下）、高通量（在一次实验中对成百上千种目标蛋白进行检测）、特异性（由抗原抗体之间的特异性结合决定）、敏感性高（可达到ng/L水平）、平行性（可以同时检测多种蛋白）、所需抗体量少，花费

14、少，检测时间短、样品检测及分析过程连续化、集成化、微型化、自动化等优点，应用该技术可同步对全基因组水平的上千种不同蛋白质进行分析。2.2 蛋白芯片技术在心血管研究中的现状蛋白芯片技术在心血管疾病的研究及应用相对滞后，目前国外刚刚起步。Dayal等15用1 l的血浆样本测定了高密度脂蛋白apoA和以及糖基化产物的表达水平发现，apoA和的蛋白峰值分别为28和17 kD，而且不与其他峰值重叠，为评估AS载脂蛋白和糖基化产物的功能及流行病学调查和治疗提供了新方法。由此可见，蛋白芯片技术在观察正常和患病心脏中调节蛋白的变化是一种较有前景的方法16。利用蛋白芯片技术研究ACS蛋白标志物国内外尚未见相关报

15、道。2.3 蛋白芯片技术在ACS研究中的设想利用蛋白芯片技术这一平台，结合其他技术，可同步分析ACS患者蛋白质谱的特点，阐明在不同发病阶段中，相关蛋白质谱的变化规律，全面展示各个病程阶段的蛋白质变化的全貌并可发现新蛋白17，18。如检测正常人与ACS患者之间、不同类型的ACS患者之间以及疾病的不同阶段的生物样品，通过研究超微量的蛋白质、高通量筛选蛋白质和鉴定生物标记，全面系统地分析比较ACS病变蛋白质图谱的特点及全貌，找出他们各自的单个或一组特异的蛋白标记，进一步分析他们的功能以及发现与之相关的新基因或新蛋白，对于了解疾病的进展和发病的分子机制，有非常重要的意义。动态分析和监视相应蛋白质的变化

16、，及时、高效地进行疾病的早期诊断，系统地、全面地、综合地评估疾病发生、进程及预后，不仅为临床疾病诊断、治疗和风险预测等提供了新途径，而且对于患者的个体化治疗也具有重要的临床价值。筛选与ACS相关的新型生物标志物，可及时发现药物作用的新靶点，甚至直接依据蛋白质的特点设计和开发新型药物。2.4 心血管蛋白芯片技术应用趋势及展望蛋白芯片技术发展到今天不过短短几年时间，目前国际上虽有几十家科研单位从事这方面的开拓性工作和应用性研究，但对心血管蛋白芯片的研发，目前国外仅有一家，而我国尚未起步。由于这一领域还处于初级阶段，更强调多种技术并存，各种方法间的整合和互补，蛋白质组学与其他学科的交叉等，以适应不同

17、蛋白质的不同特征。 心血管蛋白芯片技术的开发和应用仍有许多困难有待克服。如蛋白质的制备和纯化、如何保持蛋白质纯化后的化学和生物学性质的稳定性、现有分析仪器的灵敏度很难将体内微量的调节蛋白质精确分析、多标志物在芯片上平行分析时可能会出现的非特异性反应、对低表达蛋白质的捕获以及成千上万种蛋白质间及蛋白质与其他生物大分子间的相互作用和作用方式的复杂性等问题，仍是该技术所面临的挑战18，19。另外，便携式床边蛋白芯片分析仪的开发及应用，也可能是今后临床分子生物检测技术的发展方向之一。 综上所述，在医学科技进入后基因时代，单个蛋白标志物的研究已不能满足日益快速发展地需要，与其他的分子生物学分析方法相比，

18、多标志物联合检测、高通量分析平台蛋白芯片技术的建立和应用将有助于人类揭示ACS发生的分子机制、发现新的生物学标志及寻找更为合理有效的治疗手段和途径。【参考文献】 1 Mulvihill NT，Foley JB.Inflammation in acute coronary syndromeJ. Heart，2002；87(3)：2014.2 Mann DL.Congestive heart failureM.2nd ed.Philadelphia:Lippincon Williams & Wilkins，2000：21328.3 Balbay Y，Tikiz H，Baptiste RJ,et a

19、l.Circulating interleukin1 beta，interleukin6，tumor necrosis factoralpha，and soluble ICAM1 in patients with chronic stable angina and myocardial infarctionJ.Angiology，2001；52(2)：10914.4 Romuk E,SkrzepPoloczek B,Wojciechowska C,et al.Megalovirus with risk of cardiovascular disease：a prospective studyJ

20、.J Am Coll Cardiol，2002；40(8)：140813.5 Inokabo Y，Hanada H，Ishizaka H,et al.Plasma level of metalloproteinase1 are increased in the coronary circulation in patients with acute coronary syndromeJ.Am Heart，2001；141(2)：2117.6 Garlichs CD，John S，Eskafi S,et al.Upregulation of CD40 and CD40L ligand(CD154)

21、 in patients with moderate hypercholesterolemiaJ. Circulation，2001；104：2395400.7 李 江，彭道泉，赵水平，等.冠心病患者血清sCD40L的检测及临床意义J.湖南科大学学报，2003；28（6）：6113.8 Mulvihill NT，Foley JB.Inflammation in acute coronary snydromesJ. Heart，2002；87(3)：2014.9 彭道泉，赵水平，李毅夫，等.急性冠脉综合征患者血浆CD40L变化及其与可浓性血管黏附分子关系J.中华心血管病杂志，2002；30（3）：1414.10 宋 玮，王彬尧，王长谦，等.冠心病不同类型间斑块稳定性相关指标的比较研究J.中华心血管病杂志，2002；3(80):4802.11 Oguchi S，Dimayuga P，Zhu J,et al.Monoclonal antibody