小木虫分离过柱子经验

1、柱层析浅谈 极性小的用乙酸乙酯：石油醚系统极性较大的用甲醇：氯仿系统极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸系统拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸 硅胶柱层析下面介绍惯用的方法：匀浆法。1。称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。2。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸

2、钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。3。装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚（氯仿），装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚（氯仿）将其冲入柱中。4。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。5。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱

3、剂，而不会冲坏硅胶表面。6。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子：10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分；1-2g上样量，50g硅胶（200-300目），20-50ml收一馏分。7。检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。8。送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的“硅胶”峰。1.先根据TLC方法筛选好洗脱剂，使两相邻物质Rf值之差最大化2.将柱子必须装平整、均

4、匀3.考虑有限柱填料的吸附量4.可考虑用剃度法分开并洗脱关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。现在见到的柱子径高比一般在1：510，书中写硅胶量是样品量的3040倍，具体的选择要具

5、体分析。如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.20.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。真空液相层析即vacuum liquid chromatography(VLC),即用真空代替压力进行层析，具体方法可见Synthesis,2001,No,16,2431-,and J chem edu,1997,10,1222-干法上样，一般用于固体或粘度大的液体样品。样品用低沸点易溶溶剂溶解，加入1-3倍的粗硅

6、胶，晾干或旋干，干燥的标准是硅胶成细粉而不粘在瓶壁上。装好的柱子上留一段溶剂，把吸附了样品的硅胶慢慢到进去，震动柱子或再加一些溶剂，把粘在柱壁上的硅胶洗下常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。柱子可以分为：加压，常压，减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空

7、气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。特别是在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前

8、至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解，毕竟要分离的是敏感的东东，小心不为过。也是因为分离的东西比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。像我以前过一根无水无氧柱，需要六个schlenk，现在只一个就能把所要的全收集到。无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容

9、易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝可以做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用GF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。【主题】黄酮类化合物的分离体会【实验过程】我做的是某中药的化学成分研究，该中药中主要为黄酮类成分，遵循传统用药原则，我采取水煎煮，之后水提液浓缩至一定体积，过大孔吸附树脂，乙醇水梯度洗脱，梯度：水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、80%乙醇。每个梯度最为一个流分，再进行细分。下一步主要是运用聚酰胺柱色谱，中低压ODS，Sephadex LH20进一步分离，最好

10、制备液相得到单体化合物。【经验分享】主要和大家分享我使用聚酰胺柱的经验，我一般是聚酰胺薄膜结合聚酰胺柱，类似于硅胶板结合硅胶柱。所用的聚酰胺为30-60目，聚酰胺薄膜一盒50片，规格为8cm x 8cm，70块钱左右，可以根据需要剪成条状使用。聚酰胺薄膜常用的溶剂系统说明书上有，我常用甲醇-水，因为黄酮类化合物有一定的酸性，展开剂要加点酸，甲酸乙酸都可以，抑制其解离，保持游离状态的话，样品成点性好，否则拖尾很严重。在此需要指出的是，聚酰胺可以用反相溶剂系统，如甲醇水；也可以用正相溶剂系统，如二氯甲烷甲醇。要根据自己样品的极性来定。以我的80%乙醇洗脱物为例，进行详细的叙述。此部分极性较小。我用

11、二氯甲烷溶解，拌样，挥干。洗脱系统为甲醇水，聚酰胺柱起始用水装柱，上样，上面要放一块棉花，然后用玻璃塞子压住（聚酰胺比较轻，防止加溶剂时冲起来），甲醇水梯度洗脱。之前点板显示，50%甲醇水刚刚展开一点，因此起始用50%甲醇水洗脱，然后梯度设为55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、最后甲醇冲柱。过程中每100mL一接，蒸干转移至小瓶。最后用一大块聚酰胺对得到的流分进行合并。得到大概9-10个流分，HPLC-DAD分析，找到合适的液相色谱条件之后，用制备液相进行制备。【体会和教训】黄酮类化合物用聚酰胺分离效果非常好，但是死吸附较严重，样品比较多时可以使用，少就算了。凝胶S

12、ephadex LH20效果也非常好，建议多使用。黄酮类成分溶解性比较折磨人，但提醒一点在进行制备液相时，样品一定要用流动相溶解，或接近流动相，多加点总会溶解的，然后用0.45m滤膜过滤。不用流动相溶解很容易把柱子弄裂分。原因在于，进样之后，样品析出，堵了柱塞板，导致局部流速过快，冲塌固定相。【主题】一种中药的乙酸乙酯层浸膏的分离心得【实验过程】课题是某中药的化学成分研究，通过立式真空压力消毒罐用70%乙醇提取三次，回收，萃取，硅胶，凝胶柱，以及高效液相色谱制备的方法得到单体，到打谱的全流程。【经验分享】下面我要讲我的经验了。    课题拿来的时候就知道要分离，对于具体怎么

13、分，分哪层没有什么具体概念，这里给大家一个提议，如果想让自己的分离有点价值，建议先把各层（石油醚层，乙酸乙酯层，氯仿层，正丁醇层，水层）先做药理看看哪层有活性，或者取总皂苷，总黄铜，总生物碱，总多糖等各组分做药理，看看哪个组分有活性，再具体的进行分离，不然分出来的东西，很多也不知道有没有活性，可能东西也比较少，不够做药理的，那样分离就没有有目标的分离意义大了。1 预实验   （1）用少量的药提取，然后分层萃取，计算一下各层的出膏率，我分的乙酸乙酯层出高率就特别低，但是以前不懂也就分了，结果费了好多的药，分得的单体量还特别少，建议可以萃取完事之后进进液相看看，那层的峰多不多，

14、大不大，心里大概有个数，如果峰都特别小，那可能分这层就很费劲，浸膏当然是越多越好分了，这里还要记住一点，就是分离和你以后要做含量测定以及药理的药要都是一批药，我因为用了两批药做分离，结果在第一批药里分得的东西，在以后用第二批药的样品进高效液相的时候找不到那个峰，所以买药一定要买够，不然影响你以后做含量测定等一系列的东西。   （2）摸薄层条件，将提取好已经萃取的乙酸乙酯层用少量乙酸乙酯溶解，（这里具体用什么试剂溶解你可以自己摸摸，比如丙酮啊，氯仿啊，都行，目的是将浸膏最大程度的溶解，点板看看膏子里的各种成分）。一般乙酸乙酯层用到的展开剂配伍有：石油醚-乙酸乙酯 石油醚-丙酮

15、 氯仿-丙酮 氯仿-甲醇 乙酸乙酯-甲醇 乙酸乙酯-氯仿 一般用3：1大概看看点的分离情况，如果有分开的迹象，就可以用这个展开剂调整比例，如果拖尾很严重，或者点分开的不是很好，那么建议换一个展开剂试试。摸好条件后，把样品中的第一个点降低展开剂的极性往下拉，使第一个点的RF=0.2 这个时候展开剂的比例就是初始溶媒了，也就是你以后要上大柱子的洗脱剂的初始比例。2 正式实验     因为是大量提药，所以需要浓缩的浸膏液非常多 ，不要闲麻烦一定要用旋转蒸发仪，我就是直接在火上浓缩的，最后分出来的东西，跟样品有的对不上，怀疑是不是因为温度过高转化了，这个就不能确定啦。 

16、  好的浸膏用水融了之后放入一个貌似广口瓶的大罐子里 ，倒入跟浸膏液等体积的萃取液进行萃取，这里面要说一嘴，在用乙酸乙酯萃取的时候，禁止剧烈震摇，过于剧烈会让乙酸乙酯层产生非常强烈的乳化层，乳化层就不知道到底是上层的东西还是下层的东西了，轻轻摇的话乳化层会小一点，如果一旦产生乳化层了，可以用热抹布温一温瓶子外面，或者找个盆加热一下，大概50°左右把这个大罐子放里面，一会乳化层就下降了很多，不能说完全都变没了，只能说有好转。萃取好的浸膏液，减压浓缩，备用。    装柱：这里面大家需要知道几个比例：      

17、0;           浸膏量和拌样硅胶量=1：1-1：1.5                   浸膏量和柱层析硅胶比例=1：20-1：30                  柱层析硅胶和洗脱剂的比例=1：3       在进行大柱子粗分的时候，

18、柱层析硅胶用100-200目的。拌样硅胶用200-300目的。以后细分的时候柱层析硅胶用200-300目的。      好了，现在我们开始装柱子。用三倍量的洗脱剂将柱层析硅胶搅拌均匀，溶胀半小时左右。      这时侯我们剪棉花，棉花的直径要略微比柱子的直径小一点，剪好后用玻璃棒送进柱子底部，玻璃棒按住底部的同时，加少量的洗脱剂，排一排底部的气泡。拍好后，将容账好的硅胶研玻璃棒倒入柱子里，最好一次倒入，一次倒入不了，也尽快将剩下的倒进去，别让它分层了。装柱子的同时记录柱体积，为以后接馏分的时候做准备。装好后，沉降一

19、晚。    拌样：这里要提到的是拌样最好跟上柱子是同一天，因为拌样之后，就开始有死吸附了 ，所以，越快上样，越减少硅胶对样品的死吸附。拌样前期准备一个滴管，一个蒸发皿，称取跟浸膏重一样重的硅胶，备用。取三分之一的硅胶放入蒸发皿中，将浸膏用少量甲醇溶解，然后用滴管吸取溶解的浸膏液，每次加三 四滴左右到装好硅胶的蒸发皿中，用药匙或者研棰研磨，直至浸膏完全融进硅胶里面，再继续加浸膏甲醇液，每次滴加必须少量，加多了，硅胶对浸膏的吸附效果就不好了，直至将所有浸膏甲醇液都绊到硅胶里，期间如果硅胶吸附不进去了，可以再加点硅胶，所用硅胶量越少越好，最大不超过浸膏量的1-1.5倍。拌好后，硅

20、胶的颜色应该是均匀的颜色，如果不均匀还得继续研磨，直至均匀为止，然后在水浴锅上挥掉甲醇至无醇味，就可以上样啦。    上样：将拌好的样品用药勺均匀的撒入柱子里，一手拿药勺，另一手轻轻的磕拿药勺的手使样品坠落，不要用一只手去上样，这样你掌握不好你手的力度。尽量是样品保持在同一水平线上。上好后在样品上加1cm高的硅胶，防止以后加洗脱剂的时候把样品表面砸的不平整了。待样品被洗脱剂冲到柱子的三分之二柱子处时，开始接馏分。一般一个梯度接4-5个柱体积。    样品浓缩：接下来的馏分用圆底烧瓶浓缩，洗脱剂是可以回收的，配第一个梯度的时候用密度计测一下密度，之后用回收

21、的溶剂的时候可以用两者互相勾兑，达到原来的密度，这里要注意的是，回收的时候不要让圆底烧瓶里进水了，进水了回收的就特别慢，对以后配洗脱剂也有影响，极性就改变了。    合瓶：一般合瓶的时候用的用的硅胶板选用GF254的，这样能看到暗斑，选用的条件都是要比你这个馏分所用的洗脱剂的极性要大。比如这个馏分是石油醚：丙酮8:1下来的，那么点板用的展开剂的比例一般就是石油醚：丙酮：左右，有时候就用氯仿：丙酮10:1左右，反正就是要比洗脱剂的极性大。合瓶的时候展开剂并不是像洗脱剂那样单一的，可以用很多试剂都试一试，因为有很多东西相对比较纯了，所体现的理化性质就不同，用的显色剂也不同，比如

22、酚酸类，一般展开剂里面要加点甲酸，跑板的效果才好，而且要用三氯化铁显色，跑板摸条件是要有恒心和毅力的，大家坚持住呀，希望就在前方(*_*) 分离的各种方法的使用1 制备薄层如果你的东西不是特别多的话，就不要用了，因为制备薄层很浪费样品，制备出来的纯度也不一定够打谱，如果纯度不够还得通过液相制备。制备方法： （1）将硅胶板弄的稠一点。    （2）铺20cmX20cm的大薄层板，这样展开效果好，斑点清晰可见。    （3）板跑好后，喷显色剂的时候，用玻璃板盖住已经跑好的板，留下只有一个点的一条，进行喷板，喷好后，通过那个点上面跑出来的颜色，就大概知道刮取的

23、部位在哪了。    （4）将刮取的硅胶，用甲醇超声，将超声好的溶液滤过，滤液为所要成分。2 SephadexLH一20一般这个凝胶的洗脱剂用甲醇或者氯仿甲醇1:1到底用哪个可以看看你要上样的东西的极性，如果你的东西用氯仿：甲醇1:1溶，就用氯仿甲醇上样，洗脱。上样的时候，用最少量的洗脱剂把样品溶了，当样品溶液都下到凝胶里面了，再加洗脱剂，不然就相当于把样品稀释了一样。一般上凝胶有的东西色素太严重了，最好别上，上完之后整个凝胶的污染了，有时候再生也不能回到以前的颜色了，如果东西太混的话，建议上样之前用滤纸过滤一下，不过这样是会有损失的，所以样太少了就别滤了。我以前上过一个东西，色素全挂在凝胶上了，用纯甲醇冲了次都冲不下来，就只好把凝胶倒出来再生了，不过还好再生之后，凝胶还是很干净的。这里给大家讲一下我的凝胶的再生方法：用0.5mol/L NaOH和0.5mol/L NaCl泡凝胶，一天一宿，在50摄氏度的水浴锅里面泡，泡好后用水洗至中性，（用pH试