放线菌抗生素的发酵及目的产物的提取实验报告

1、放线菌抗生素得发酵及目得产物得提取一、实验目得1、熟悉掌握土壤中分离抗生素及培养方法2、了解与掌握种子制备与摇瓶发酵技术与方法3、了解抗生素发酵得一般规律与代谢调控理论4、 了解小型发酵罐得基本结构5、熟悉掌握小型发酵罐得使用方法与保养6、掌握抗生素生物效价测定得原理与方法；7 .掌握管碟法测定抗生素生物效价相关得操作方法。8 .掌握放线菌次级代谢物得初步纯化及牛津杯实验得基本原理与操作技术二、实验原理发酵罐就是进行液体发酵得特殊设备、生产上使用得发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用得小型发酵罐，其容积可从约1L至数百升或稍大些。一般来说，5L以下就是用耐压玻璃制作罐体,5L以上

2、用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器与各种电极，可以自动地调控试验所需要得培养条件，就是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需得设备。抗生素(antibiotics)就是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生得具有抗病原体或其它活性得一类次级代谢产物，能干扰其她生活细胞发育功能得化学物质、现临床常用得抗生素有转基因工程菌培养液液中提取物以及用化学方法合成或半合成得化合物放线菌发酵结束后，次级代谢物可能与菌体结合，工业上常采用草酸或磷酸等酸化剂处理，释放与菌体结合得次级代谢物，并采用加热发酵液70C,2min使蛋白凝固，所得酸性滤液，在经碱处理，进一步去

3、除蛋白。抗生素得效价常采用彳生物学方法测定，它就是利用抗生素对特定得微生物具有抗菌活性得原理来测定抗生素效价得方法，如管碟法。管碟法就是目前抗生素效价测定得国际通用方法，我国药典也采用此法。管碟法就是根据抗生素在琼脂平板培养基中得扩散渗透作用，比较标准品与检品两者对试验菌得抑菌圈大小来测定供试品得效价。管碟法得基本原理就是在含有高度敏感性试验菌得琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0、lmm，外径8o0±0.lmn，高10±0.lmm）,管内放入标准品与检品得溶液，经1618小时恒温培养，当抗生素在菌层培养基中扩散时，会形成抗生素浓度由高到低得自然梯度，即扩散中心浓

4、度高而边缘浓度低、因此，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时,试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明得无菌生长得区域，常呈圆形，称为抑菌圈。根据扩散定律得推导，抗生素总量得对数值与抑菌圈直径得平方成线性关系，比较抗生素标准品与检品得抑菌圈大小，可计算出抗生素得效价。常用得管碟法有：一剂量法、二剂量法、三剂量法。后二法已经列入药典、二剂量法系将抗生素标准品与供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）得两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数与抑菌圈直径成直线关系得原理来计算供试品效价。取含菌层得双层平板培养基,每个平板表面放置4个小钢管,管内分别放入供试品高、低剂量

5、与标准品高、低剂量溶液、先测量出四点得抑菌圈直径,按下列公式计算出检品得效价。(1)求出WWV:W=(SH+UH)-(SL+UL)(式2、10-1)V=(UH+LL)-(SH+SL)(式2、10-2)式中：UH:供试品高剂量之抑菌圈直径；UL:供试品低剂量之抑菌圈直径；SH:标准品高剂量之抑菌圈直径;SL:标准品低剂量之抑菌圈直径；(2)求出0:0=Dantilog(IV/W)(式2、10-3)式中：0:供试品与标准品得效价比；D:标准品高剂量与供试品高剂量之比,一般为1I:高低剂量之比得对数，即log2或log4。求出Pr:Pr=Arx0(式2。10-4)式中:Pr:供试品实际单位数;Ar:

6、供试品标示量或估计单位甲醛滴定法测定氨基氮含量:水溶液中得氨基酸为两性离子,因而不能直接用碱滴定氨基酸得竣基。用甲醛处理氨基酸，甲醛与氨基结合,可形成羟甲基衍生物，使NH3+上得H+游离出来，这样就可用碱滴定NH3+放出得H+,从而计算出氨基氮含量。如样品中只含有某一种已知氨基酸，由甲醛滴定得结果即可算出氨基氮得含量。如果样品就是多种氨基酸得混合物（如蛋白质水解物）,则滴定结果不能作为氨基酸得定量依据。甲醛滴定法常用于测定蛋白质得水解程度，随着水解程度得增加，滴定值增加，当水解完全后，滴定值保持恒定。甲基红得变色范围就是PH4.46.2,意思就是说：1.其pH值在4。46、2区间时，呈橙色，2

7、。其pH值至4.4时，呈红色，因就是靠近酸性强得一边时得颜色，故又称之为酸色、3.其pH值三6、2时，呈黄色，因就是靠近碱性强得一边时得颜色，故又称之为碱色二、仪器与材料（一）培养基高氏一号培养基：可溶性淀粉20.0gNaCl0。5gKNO31、0gK2HPO0、5gMgSQ.7H2O0、5gFeSO4。7H2O0、01g蒸储水1000ml,PH7。4,发酵瓶培养基：淀粉3%,葡萄糖2%,黄豆饼粉2。5%,蛋白月东0。5%,酵母粉0。5%,MgSO40。1%,(NH4)2SO40。3%,KH2PO4,0、03%,CaCO30。4%,PH6、0。黄豆饼粉4g,淀粉10g,酵母粉0、25g,蛋白月

8、东1。5g,MgSO40.025g,CaCO30。4g,(NH4)2SO40.3g,%淀粉酶(105u/ml)0、01ml。100mlPH7047、6可溶性淀粉2.0g,NaClO005g,KNO30。1g,K2HPO40。05g,MgSO4.7H2O0、05g,FeSO47H2O0、001g,加蒸储水至100ml,PH7.4,牛肉膏蛋白陈牛肉膏（5。0g）,蛋白陈（10、0g）,NaCl（5g）,蒸储水（10O0mL）,pH7、27、4发酵罐培养基（2L）:黄豆饼粉80g淀粉200 g酵母粉蛋白月东 30gM gSO0、5 gCaCQ 8g(NH4)2SO4?一淀粉酶（105u/ml）0、2

9、ml（二）流加补料碳源:葡萄糖（1 0%）3 0 0 ml,控制1%;20 0 0*1 %=20 g ,200ml氮源：硫酸镂（10%）250ml，控制16%调 PH1: 0 .1MHC l0。 1 MNaOH（三）分析指标及方法所用试剂及溶液测残糖一DNSfe1、 3,5二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）:将6。3g得3,5二硝基水杨酸与2molNaOH溶液加到500ml含有182g酒石酸钾钠得热水溶液中，再加5g结晶苯酚与5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸储水定容到1000ml2、 1。0mg/m1葡萄糖溶液：称取1g葡萄糖，加蒸储水定容到1L。3、 6mo1/1氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠24

10、g,加蒸储水定容到100ml。4、 6mol/l得盐酸:取浓盐酸49、68ml,加蒸储水定容到1 00ml。测残氮得方法甲醛法1。 甲基红:0、1g甲基红，用95%乙醇定容100ml、2。 003moi/LHCL:取浓盐酸2。48ml,加蒸储水定容到100ml。3。 0、02858mol/LNaOH:称0、11432g，定容100ml。4。 1酚酞指示剂:称取1g酚酞指示剂粉末、溶于100ml95乙醇溶液中、5。 95%醇：取乙醇96ml,倒入100ml容量瓶中定容值100ml、6。 18%M生甲醛：取48ml38嘀甲醛力口入小于100ml容量瓶，往溶液中加两滴酚酞用氢氧化钠滴定刚好变红,定容

11、到100ml。（四）器材玻璃试管、试管架、吸管(1ml,2ml,10ml)、吸耳球、离心管、容量瓶、烧杯、三角瓶(250ml,500ml)、量筒(250ml,500ml,1000ml)、玻璃棒、试纸、塑料漏斗、电炉、接种铲(针)、振荡培养箱、恒温箱、台秤、5L一发酵罐，无菌室、培养皿(直径9cm)、陶瓦盖、钢管、钢管放置器、恒温培养室、灭菌刻度吸管、玻璃容器、称量管、毛细滴管、天平、直尺或游标卡尺、超净工作台，无菌培养皿,酒精灯，牛津杯,镣子,移液器等等(五)、生物效价测定所需材料菌种：大肠杆菌(Escherichiacoli),菌液浓度约为106个/mL。菌株保存得时间过久，影响其对抗生素得

12、敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样得结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中得稀释倍数、(2)抗牛素标准品与供试品:头抱拉定标准品与供试品。(3)培养基：效价检定用培养基1号。(4)无菌缓冲液：称取磷酸氢二钾5.59g,磷酸二氢钾0、41g,加水1000mL即为pH7.8得磷酸盐缓冲液。制备缓冲液得试剂应为分析纯，配制后得缓冲液应澄清，分装于玻璃容器内，经121c蒸气灭菌30min备用。草酸，10MNaOH四、实验步骤筛选高产放线菌从土壤里筛选出高产放线菌,于斜面培养基中保藏接种在超净工作台上，将长好得斜面抱子用无菌接种针挖块

13、约0。5X1 cm2,接种于灭过菌得高氏一号培养基中。培养将接种好得种子摇瓶于28C恒温室摇床上，转速为200r/min,培养48小时左右。实罐灭菌1 、将冷凝水管路断开,拔下电极,打开罐盖,将发酵培养基装入发酵罐及补料瓶,易产生泡沫得培养基尽量不要超过两升、2?、连接管路:取样管路连接,补料管路连接;空气过滤器用硅胶管与罐盖空气管连接,并用弹簧夹夹紧;排气口与过滤器用硅胶管连接;安装温度电极、pH电极、溶氧电极，pH电极用们帽盖紧电极上端口，溶氧电极用铝铂纸包裹电极上端口,防止受潮。盖紧其它罐盖接口。3?、提起玻璃罐体及补料瓶放入灭菌锅,盖好牛皮纸,盖好锅盖,确定发酵温度及时间、4、灭菌结束

14、后,尽快将罐放回原位并尽快通入空气。发酵操作1、将灭菌后得罐体放回原位，连接冷凝水管路，通入冷凝水，连接通气管路，调整通气量至35L/min。？2、将温度电极、pH电极、溶氧电极与控制器连接。？3、补料管连接：打开补料蠕动泵防护盖,搬开进出口处得白色管夹,将硅胶管嵌入入口处得管夹并夹紧，用手转动泵头，将硅胶管沿凹梢安装直至出口处，开手动开关约十秒后夹紧出口处管夹，关手动开关；将酒精棉球放在罐盖补料口内，将针头插入并穿透密封盖；可开蠕动泵手动开关，使输液管中充满料液，置于自动状态。接种将培养48小时得摇瓶种子接种于发酵罐中，使用接种圈放置酒精棉点燃，进行无菌接种，接入100ml种子、接种后立即进

15、行第一次取样、发酵生产发酵过程得测定：发酵液状态观察：粘度、颜色、气味、菌丝形态发酵中残糖得测定一DNS&:1。取1。0mg/m1葡萄糖标准溶液，按下表加入试剂。沸水浴加热5min,冷水冷却定容至25ml摇匀，在520nm按波长测吸光度。编号葡萄糖标准溶液/ml水/ml溶液糖含量/mgDNS试剂/ml1 ?01、80?1。50.2?1、50.41、51、51.51、01、412 51.6?1。520、41.630、6?1、40?640。8122?0。851.01。01、561.2?0.8?1、21?。571。40.681。60.42、取发酵液0。5m1置于50ml容量瓶中，力口6mol

16、/l得盐酸溶液2ml,在沸水溶液中加热15min水解，冷水冷却后及时6mo氢氧化钠溶液1、8ml,并定容到50ml得总糖水解液。3.取总糖水解液2ml于25m1比色管中，加入DNS试剂1。5ml沸水浴中加热5min，冷水冷却后定容至25ml摇匀，以空白作对照在520nm波长测吸光度。氨基酸氮得测定：甲醛法（陈钧鸣与徐玲娣，1991）、取2ml发酵液滤液于三角瓶内，加蒸储水10ml,甲基红指示剂2滴，用。3MHCI调节pH至溶液呈红色，再用0、02858MNIaOH容液调pH至溶液呈橙色（中性），加18%中性甲醛溶液4ml,摇匀，静置10min,加l%酚醐指示剂8滴，用0。02858NNaOHf

17、e准溶液滴定至微红色为终点。氨基氮得计算公式为：氨基氮（mg/l00ml）=滴定体积*2放线菌次级代谢物得初步纯化及牛津杯实验得1、配制培养基身压火困。2 、倒平板。3 、涂布指示菌。4、以无菌操作在培养基表面直接垂直放上牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙。5、收集发酵液，缓缓加入草酸将发酵液酸化至pH1、43.0左右,70C,2min,以10000rpm离心20min。6、取上清加入水稀释20溢右，在4C,用10MNaOH中与至pH6.46、8、7、吸取中与液100wL加入牛津杯中，37C培养16hr,观察结果、效价测定1 。称量称量前,将抗生素标准品与供试品从冰箱取出,使与室温平衡,

18、供试品应放于干燥器内至少30min方可称取。供试品与标准品应用同一天平；吸湿性较强得抗生素在称量前12小时更换天平内干燥剂。标准品称量不可少于20mg,取样后立即将称量瓶或适宜得容器及被称物盖好,以免吸水称样量得计算W可*C/P（式2、104）式中:W:需称取标准品或供试品得重量（mg）V:溶解标准品或供试品制成浓溶液时用容量瓶得体积量（mL）C：标准品或供试品高剂量得浓度（U/mL,wg/mL）P：标准品得纯度或供试品得估计效价（U/mg小gmg）2 、稀释从冰箱中取出得标准品溶液,必须先在室温放置,使其温度达到室温后,方可量取。标准品或供试品溶液得稀释应采用容量瓶,每步稀释,取样量不得少于2mL,稀释步骤一般不超过3步。每次吸取溶液用胖肚吸管或密刻度玻璃吸管，量取溶液前要用被量液流洗吸管23次,吸取样品溶液后,用滤纸将外壁多余液体擦去,从起始刻度开始放溶液、稀释标准品与供试品用得缓冲液应同一批与同瓶,（预计不够时,应事先与另一瓶混匀后再用）,以免因pH或浓度不同影响预定结果。稀释时,每次加液至容量瓶近刻度前,稍放置片刻,待瓶壁得液体完全流下,再准确补加至刻度、标准品与供试品高低浓度之比为2:1或4:1,但所选用得浓度必须在剂量反应直线范围内。3. 双碟制备在超净工作台上，用灭菌大口吸管（20mL）,取已融化得培养基20