肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表达

1、人心肌肌酸激酶MB同功酶的克隆及原核表达李子颖作者单位： 原子高科股份有限公司（北京 102413）；2中国食品药品检定研究院（北京 100050）；3 中国原子能科学研究院通讯作者： 李子颖，E-mail：ciaelee，贾娟娟2，刘一兵1，韩世泉3【摘要】 目的 构建人肌酸激酶MB同工酶的原核表达系统，纯化重组酶蛋白并检测其活性。方法 从购买的含CKM、CKB基因片段的质粒中扩增人肌酸激酶M、B亚基基因，构建pGEX-4T-1-CKMB Ecoli BL21 (DE3)GST原核表达系统。以异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达。利用重组蛋白的GST标签亲和层析纯化。结果

2、 重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期相符，诱导表达后细菌裂解液纯化后SDSPAGE在分子量110,000（CKMB）处显示单一蛋白条带，采用酶联免疫分析的方法进行免疫活性实验，所得的蛋白和CKB、CKM抗体都有免疫结合。结论 成功表达并纯化了人肌酸激酶MB同工酶。 【关键词】：人肌酸激酶MB同工酶；原核细胞；基因表达Cloning and prokaryotic expression of humn creatine kinase-MB isoenzyme(CK-MB)Li Zi-ying*, Jia Juan-juan, Liu Yi-bing, Han Shi-quan（*Atom H

3、ighTech Co., Ltd.， Beijing，102413 ，China）【Abstract】 Objective To clone the whole gene of human creatine kinase MB isoenzyme(CK-MB) and express in prokaryotic cells, then purify recombinant CK-MB and determine its antigen-binding activity. Methods The CKM、CKB gene were amplified from plasmid we bough

4、t and insert into prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with GST tag. The construct recombinant plasmid pGEX-4T-1-CKMB was transformed to E coli. BL21(DE3) for expression under induction of IPTG. The expressed fusion protein was purified by GST chromatography, then determined antigen-binding activ

5、ity by ELISA. Results PCR、restriction analysis and sequencing proved that recombinant pGEX-4T-1-CKMB was constructed correctly. The expressed recombinant fusion protein with relative molecular mass 110 000 showed specific binding to policolonal antibody against CKM and CKB. Conclution The CK-MB was

6、successfully expressed in prokaryotic cells and purified.Key words Humn creatine kinase-MB isoenzyme；Prokaryotic cells；Gene expression急性心肌梗死(acute myocardial infarction AMI)患者存活率的关键是早期快速诊断，因为心肌细胞在梗死6 h后通常不可逆转。对于诊断急性心肌梗死(AMI)，目前心肌标志物中的肌酸激酶(creatine kinase MB， CK-MB)质量被视为诊断急性心肌梗死较敏感的指标之一1。肌酸激酶同工酶CK-MB

7、主要存在于心肌细胞中。急性心肌梗死(AMI)时心肌细胞受损，膜的完整性和通透性改变，使细胞内的大分子逸出，能在外周血中被检测到。这些大分子物质被称为心肌损伤标志物。在这些心肌标志物中CK-MB是升高较早，上升幅度较大的一种酶，也是迄今为止诊断AMI最佳且临床上应用最广泛的血清酶指标之一。AMI后CK-MB于4 h升高，16 24 h达高峰 ，4872 h恢复正常，其升高程度能较准确地反映梗死的范围，其高峰出现时间是否提前有助于判断溶栓治疗是否成功2-4。目前CK-MB质量的检测是采用免疫分析的方法，需要使用大量高质量的标准品和抗体5-7。由于人CK-MB天然来源的有限性，通过基因工程重组CK-

8、MB来制备高质量免疫原和标准品成为重要的途径8-11。1、 材料与方法11 质粒、菌株及细胞 原核表达载体PGEX-4T-1（含GST标签）本实验室保存；过渡载体pEASY-Blunt simple cloning kit和感受态 Trans-TOP-1、E.coli BL21(DE3)购自TransGen公司，含CKM、CKB基因序列的质粒SC319293、SC119007购自Origene 公司。12 主要试剂及仪器PCR产物纯化试剂和胶回收试剂购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶NdeI、EcoRI、XhoI及T4DNA连接酶为NEB公司产品； GST

9、亲和层析柱购自GE公司；CK-B、CK-M多克隆抗体为华大蛋白公司产品； Gel Doc XR凝胶成像系统、C1000 PCR仪、电泳仪及电泳槽为BIO-RAD公司产品。13 引物设计及合成 根据发表的人CK-B、CK-M基因序列设计引物如下：CK-B上游引物B1为5 CGCATATGCCCTTCTCCAACAGCCACAAC 3；CK-B下游引物B2为5 GCGAATTCTTTCTGGGCAGGCATGAGGTC 3；CK-M上游引物M1为5 CGGAATTCCCATTCGGTAACACCCACAAC 3； CK-M下游引物M2为5 GCCTCGAGCTTCTGGGCGGGGATCATGTC

10、 3划线部分分别为Nde I、EcoR、EcoR和Xhol酶切位点。扩征片段大小为1041bp。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。14 CK-B、CK-M的基因扩增 以质粒 SC319293为模板B1、B2为引物PCR扩增CK-B基因。以质粒 S SC119007为模板，M1、M2为引物PCR扩增CK-M基因。反应条件为94预变性5min、94变性30s，55退火30s，72延伸60s,30个循环后,72延伸7min，4保存。扩增产物取5l样品进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。15 pEASY-Blunt-CK-B/CK-M质粒的构建与鉴定将胶回收得到CK-B，CK-M基因扩增产物与pEASY

11、-Blunt载体质粒连接，构建pEASY-Blunt-CK-B质粒，转化感受态Trans-TOP-1，用含氨苄抗性的LB琼脂平板培养基筛选阳性菌落，Nde I和EcoR/EcoR和Xhol双酶切鉴定、并送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成测序。16 PGEX-4T-1-CKMB重组质粒的构建与鉴定将鉴定正确的pEASY-Blunt-CK-B/CK-M质粒经Nde I和EcoR/EcoR和Xhol双酶切、胶回收纯化，与经同样双酶的PGEX-4T-1质粒在T4 DNA连接酶作用下，于室温进行连接10min；联结产物转化感受态Trans-TOP-1。筛选阳性克隆经PCR及酶切鉴定。 将验证正确的PG

12、EX-4T-1-CK-M质粒经EcoR和Xhol双酶切、胶回收纯化小片段，并与经同样双酶切的PGEX-4T-1-CK-B的质粒在T4 DNA连接酶作用下，室温连接10min，然后转入感受态Trans-TOP-1。筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定并送至北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成测序。17 CK-MB融合蛋白的诱导表达。将鉴定正确的重组表达质粒转化感受态E.coli BL21（DE3），挑取阳性菌株，加入含Amp(100g/mL)的LB培养基中，37增菌12h；再按1：100的比例加入到新鲜LB培养基中，37培养至菌体A600值为0.6-1.0时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，25诱

13、导6h，离心收集菌体，4超声裂解，离心，分别收集上清和沉淀，进行8%SDS-PAGE分析。18 表达产物的纯化 按照1.7的条件大量诱导表达融合蛋白，菌液6000rpm 离心30分钟后，弃上清，将沉淀重悬于含一定浓度TritonX-100、二硫苏糖、L-半胱胺酸的GST平衡缓冲液中，4超声裂解后收集可溶性蛋白，用GST亲和层析柱纯化，洗脱、透析脱盐处理后，经SDS-PAGE分析纯化效果。19 CK-MB抗原活性的鉴定采用酶联免疫分析方法，即将重组表达的CKMB融合蛋白包被于酶标板上（100L/孔），然后加入一定浓度的CK-B/CK-M兔多抗，37温浴1h，洗涤液洗涤3次后，加入一定浓度的HRP

14、-驴抗兔（100L/孔），37温浴30min，洗涤3次后，加入显色液（100L/孔），37温浴15min，最后加入 2M硫酸（50L/孔）终止反应，读取OD450值。2、结果 21 CKM、CKB基因扩增产物的鉴定CK-M、CK-B基因PCR扩增产物取5L样品进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见1041bp的特异条带，见图1。M：DNA Marker；1：CK-M基因PCR扩增产物；2：CK-B基因PCR扩增产物图1 CK-M、CK-B 基因PCR扩增产物电泳图Fig 1. Electrophoretic profile of PCR product of CKMB gene2. 2重组原核表达质

15、粒的鉴定重组表达质粒PGEX-4T-1-CK-MB经菌落PCR和双酶切后（Nde I和 Xhol），经1%琼脂糖凝胶电泳分析，可见约2000bp的目的基因条带，大小与预期一致，见图2。序列分析结果显示，得到的基因序列与预期完全一致。ABA：PCR鉴定（1：阳性克隆；2-8，10：阴性克隆；9：阴性对照；M：DNA Marker）；B：双酶切鉴定（1，3：阴性质粒；2，4：阳性质粒；M ：DNA Marker）图2 重组表达质粒pGEX-4T-1-CK-MB 的PCR及酶切（Nde I/Xhol I）鉴定Fig 2.Identification of recombinant plasmid PG

16、EX-4T-1-CK-MB by PCR and restriction analysis（Nde I/Xhol I）2. 3表达产物的鉴定8%SDS-PAGE 分析显示，带有GST标签的PGEX-4T-1-CK-MB的诱导表达产物可见相对分子质量约为110 000的特异蛋白表达条带，大小与预期相符。主要以包涵体的形式存在。M：蛋白Marker；1-3：诱导表达重组菌的破菌上清；4：诱导表达重组菌的破菌沉淀图3 CK-MB表达产物的SDS-PAGE分析Fig 3.SDS-PAGE profile of expressed fusion protein2. 4重组CK-MB蛋白免疫活性测定酶联免

17、疫分析结果显示，重组的融合蛋白CK-MB与CK-M、CK-B多抗均能够结合结合，证明重组蛋白具有免疫活性。图4 CK-MB抗原结合活性鉴定Fig 4. Identification of antigen-binding activity fo CK-MB3、 讨论肌酸激酶主要存在于动物的 心脏、骨骼肌及脑组织的细胞质和线粒体中，参与细胞内能量转运、肌肉收缩、ATP再生等过程。胞质型肌酸激酶为二聚体酶，由M、B亚基分别聚合为 MM、MB、BB 3种同工酶形式。MM型主要存在于骨骼肌， 而BB型则是肌酸激酶在大脑中的主要存在形式，MB型则主要存在于心肌中。B型、M型亚基由381个 氨基酸组成，分子

18、量约为43 00012。本实验室构建了PGEX-4T-1-CK-MB/E. coli BL21(DE3) 原核表达系统，克隆表达的CK-MB在N端带有分子量约为26 000道尔顿的GST标签，使表达蛋白总大小达到约110 000。由于带有GST标签，可以用GST亲和层析柱进行蛋白的纯化。具有上样量大提纯效率高的特点，能够方便快捷的得到大量纯化重组蛋白。抗原结合活性鉴定结果表明重组蛋白能够和CK-M与CK-B的抗体结合，表明重组蛋白同时具有CK-M和CK-B的反应原性。从实验中可以看到使用该表达质粒在合适的诱导条件下能够表达出大量的蛋白，可以满足大量生产使用的需求。但重组蛋白多以包涵体的形式存在

19、，为使重组蛋白接近天然蛋白的活性，我们还在进一步对重组蛋白进行复性研究和去GST标签的研究。参考文献1 廖俐雅，熊中政血清肌酸激酶同功酶MB的实验室诊断进展J现代医疗卫生，2007，23（10）：14722 贾思公血清肌钙蛋白T与心肌酶谱指标联合检测用于急性心肌梗死诊断临床价值浅析J中国实用医药，2012，7（3）：122-1233Leickt L, Grubb A, Ohlson SDevelopment of monoclonal antibodys against creatine kinase MB2JScand K Clin Lab Invest，2002,，62：423-4304

20、周林华，李田科，邓德耀，等肌酸激酶在急性心肌梗死诊断中的应用价值分析J检验医学与临床，2011，8（5）：586-587。5 Christenson RH，Vaidya H， Landt Y，et alStandardization of creatine kinase-MB (CK-MB) mass assays：the use of recombinant CK-MB as a reference materialJClinChem，1999，45：1414-236 Garay F，Kisiel G，Fang AP，et alSurface plasmon resonance aid edelectrochemical immunosensor for CK-MB determination in undiluted serum samplesJAnal Bioanal Chem，2010，397：187318817 刘芳，张勇化学发光法同放射免疫法检测肌酸激酶比较J2011, 1(13)：143-1448 黄燕，杨文双，徐国宾，等人肌酸激酶MM同工酶在