受体分析检查检验核医学课件

1、受体分析检查检验核医学1受体的放射性配体结合分析受体的放射性配体结合分析radioligand binding assay of receptors, RBA受体分析检查检验核医学2v受体受体（receptor）是细胞膜上或细胞内的一些能与生物活性物质相互作用相互作用并引起特异性生引起特异性生物效应物效应的物质。v受体与其配体配体（ligand）结合后，通过受体特定的信号传导系统，引起细胞的特定反应，是高等动物适应环境、协调机体各种细胞功能的关键性分子。受体分析检查检验核医学3v受体的放射性配体结合分析受体的放射性配体结合分析（radioligand binding assay of rece

2、ptors，RBA）是用放射性核素标记的配体与相应的受体进行特异性结合反应，从而对受体进行定性或定量分析。放射性配体+受体分子受体配体 复合物分离B与F测定，计算受体数量及亲和力受体分析检查检验核医学4v定量定量RBA是在已知配体与受体反应的基础上，通过结合反应得知一定数量的组织或细胞与该放射性配体结合的受体数量受体数量，即结合位点结合位点数数。配体与受体的亲和力亲和力以结合反应的平衡解离常数表示。v定性定性RBA则通过反应量效关系、某些参数的变化等判断受体的类型类型、结合方式结合方式（单位点系统或多位点系统）、受体与配体相互作用作用特点特点等。受体分析检查检验核医学5一、RBA的主要优点v1

3、、高灵敏度高灵敏度v2、特异性强、专一性好特异性强、专一性好v3、受体制剂的多用性受体制剂的多用性受体分析检查检验核医学6二、受体的分类二、受体的分类v膜受体v核受体受体分析检查检验核医学7（一）膜受体v由胞膜外、胞膜内、跨膜区组成。按跨膜区又可分为：v1、G蛋白偶联受体（神经递质、前列腺素等）v2、单一跨膜区有激酶活性受体（细胞因子）v3、单一跨膜区无激酶活性受体（生长因子、INS）v4、离子通道型受体（Na+、K+、Cl-、Ca+等）受体分析检查检验核医学8受体分析检查检验核医学9v2 2、核受体、核受体 v受体在细胞核上，通过与细胞核内特定的DNA结合后影响遗传信息的转录。核受体一般是由

4、4001,000个氨基酸残基组成的可溶性单体蛋白质。氨基端是高度可变区氨基端是高度可变区，与转录的特异性有关。中间是中间是DNADNA结合区结合区，富含半胱氨酸，含有两个“锌指”结构，受体通过“锌指”与DNA结合；该区域部位保守性强。羧基羧基端为激素结合区端为激素结合区。 v糖皮质激素受体类、性激素受体类、甲状腺激素受体类。受体分析检查检验核医学10三、受体与其配基作用的特点三、受体与其配基作用的特点v1可饱和性v2可逆性v3、特异性和亲和力v4生物效应的一致性 v5. 需具有内源性配体 受体分析检查检验核医学11v1 1可饱和性可饱和性v每个细胞所含的受体数目有限，故配体与受体的结合反应具有

5、可饱和性，呈高亲和力和低容量。v2 2、可逆性、可逆性v配体与受体的结合是可逆的，当受体周围配体浓度降低，结合反应就逆向进行，即配体与受体解离，解离后的配体是原形，不起代谢变化。受体分析检查检验核医学12v3、特异性特异性和亲和力亲和力v受体有特异识别配体的作用，只有严格构型和构象的配体才能选择性地与某受体结合。受体的特异性还表现在器官或组织的专一性。受体的亲和力表明其与配体的结合能力，高亲和力说明受体配体结合牢固。平衡解离常数在10-9mol/L以上的被认为高亲和力受体。受体分析检查检验核医学13v4生物效应的一致性生物效应的一致性v受体的主要功能是介导配体的生物效应，如一种蛋白质与某种物质

6、结合而不介导特定生物效应，则此蛋白质不能称之为受体。v5. 5. 需具有内源性配体需具有内源性配体v受体都需有内源性配体，如果通过外源性配体发现某种蛋白质分子具有类似受体的特性，但未找到内源性配体，则称之为孤儿受体，不能认为是真正的受体。受体分析检查检验核医学14四、单位点系统四、单位点系统RBA的基本原理的基本原理v1 1、简单单位点系统受体配体相互作用的基、简单单位点系统受体配体相互作用的基本规律本规律v 不少受体与配体结合的系统只存在一种结合位点，即简单单位点系统，其基本规律符合质量作用定律质量作用定律。质量作用定律质量作用定律受体分析检查检验核医学15 1=1RL， 2=2RL平衡时：

7、平衡时：1RL= 2RL则平衡解离常数：则平衡解离常数： KD=2/1=R.L/RL KD是平衡解离常数是平衡解离常数,为平衡亲和常数为平衡亲和常数KA的的倒数，单位为倒数，单位为mol/L，KD越大表示亲和越大表示亲和力越低。力越低。 受体分析检查检验核医学16设 受 体 和 配 体 的 初 始 浓 度 为设 受 体 和 配 体 的 初 始 浓 度 为 R T 和和LT,R=RT-RL，L=LT-RL，则：，则：v经整理后得：经整理后得：v RL2 RLRT + LT + KD + RTLT= 0 对特定配体和某一固定量的特定受体，对特定配体和某一固定量的特定受体，RT和和KD均是定值，于是

8、均是定值，于是RL仅随仅随LT而变，而变，二者呈双曲线函数关系。二者呈双曲线函数关系。 RLRLLTRLRTRLLRLRTKD受体分析检查检验核医学17v2 2、饱和曲线、饱和曲线v简单单位点系统简单单位点系统RBA应能得到典型的饱和曲应能得到典型的饱和曲线。以线。以RL为纵坐标，为纵坐标，LT为横坐标，得到为横坐标，得到RL随随LT变化的曲线。配体的浓度从零开变化的曲线。配体的浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大部分受体都与配体结合，逐渐变慢，最后绝大部分受体都与配体结合，即受体饱和了。此就是即受体饱和了。此就是饱和曲线。饱

9、和曲线。v饱和曲线趋向水平则说明饱和曲线趋向水平则说明大部分受体已与配大部分受体已与配体结合体结合。受体分析检查检验核医学18受体分析检查检验核医学19（1）总结合）总结合（total binding，TB）v受体与标记配体结合时，测量得到的放受体与标记配体结合时，测量得到的放射性还含有一部分（反应管壁吸附、杂射性还含有一部分（反应管壁吸附、杂蛋白吸附、分离不完全等）未与受体结蛋白吸附、分离不完全等）未与受体结合的标记配体的放射性，需将此部分减合的标记配体的放射性，需将此部分减去才能得到特异结合计数。去才能得到特异结合计数。受体分析检查检验核医学20（2）非特异结合）非特异结合（non-spe

10、cific binding，NSB）v放射性配体除与受体特异性结合外，尚可与其他成放射性配体除与受体特异性结合外，尚可与其他成分结合，称之为分结合，称之为NSB。主要来自杂蛋白、反应器壁、。主要来自杂蛋白、反应器壁、分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力小，分离材料的吸附等。特点是结合容量大而亲和力小，不会出现饱和现象，结合量与所使用的配体量呈线不会出现饱和现象，结合量与所使用的配体量呈线性关系。性关系。v常做一系列平行管，条件与常做一系列平行管，条件与TB相同，多加相同，多加200 1000倍非标记配体以取代标记配体与受体结合，测倍非标记配体以取代标记配体与受体结合，测得的即得的即NSB

11、。 受体分析检查检验核医学21（3）特异结合）特异结合（specific binding，SB）v受体与标记配体结合的放射性计数，无法直受体与标记配体结合的放射性计数，无法直接获得。常用相同浓度的接获得。常用相同浓度的TB减去减去NSB求得。求得。受体分析检查检验核医学22TBSBNSB受体分析检查检验核医学23五、离体五、离体RBA的基本方法的基本方法 制备待测受体的离体标本制备待测受体的离体标本加放射性配体温育一定时间加放射性配体温育一定时间终止反应、分离结合与游离部分终止反应、分离结合与游离部分测定结合部分的放射性测定结合部分的放射性数据处理、求出有关参数数据处理、求出有关参数受体分析检

12、查检验核医学24（一）基本试剂及制备（一）基本试剂及制备v1、受体样本、受体样本v2、放射标记配基、放射标记配基v3、非标记配基、非标记配基受体分析检查检验核医学251、待测受体标本的制备、待测受体标本的制备 v用于离体用于离体RBA的标本大体可分为组的标本大体可分为组织切片、完整细胞悬液、经初步分织切片、完整细胞悬液、经初步分离的细胞组分及经增溶或进一步纯离的细胞组分及经增溶或进一步纯化的受体蛋白等。化的受体蛋白等。受体分析检查检验核医学26v1）组织切片）组织切片v为保持受体活性，常用冷冻组织切片，厚度550 m，将其贴于涂有明胶的玻片上，在温育缓冲液中与标记配体进行反应。反应后洗去游离部

13、分。可刮下切片测量其放射性活度，也可用放射自显影或免疫组化研究受体分布。受体分析检查检验核医学27v2）完整细胞悬液的制备）完整细胞悬液的制备v血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。血细胞可用通常分离血中有形成分的方法分离。 从从组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织，再将游组织中分离细胞一般是用胶原酶处理组织，再将游离的细胞分离出来。离的细胞分离出来。v用完整细胞进行用完整细胞进行RBA的的主要优点主要优点是可同时观察配体是可同时观察配体与受体结合的情况与受体结合的情况和和细胞的生物效应细胞的生物效应，得到的结果，得到的结果更能反映受体的生理特性。此外，还可更能反映受体的生理特性。此外，还

14、可直接给出直接给出平平均每个细胞的均每个细胞的受体数目受体数目。缺点是在处理过程中有时。缺点是在处理过程中有时可能导致细胞表面生理活性的改变。有时受体在细可能导致细胞表面生理活性的改变。有时受体在细胞中的含量很低，则需用较大量的细胞才能作一次胞中的含量很低，则需用较大量的细胞才能作一次实验。实验。受体分析检查检验核医学28v3）细胞组分的分离）细胞组分的分离v组织匀浆多数RBA使用细胞组分进行分析。其优点是：去除了大部分杂蛋白和内源性配体，减少NSB或其他因素的干扰；受体蛋白得到初步浓缩，受体制剂的富集可获得可靠的实验结果。受体分析检查检验核医学29组织匀浆组织匀浆沉淀：完整细沉淀：完整细胞、

15、核受体胞、核受体上清液上清液8003500g, 1015 min沉淀：线粒沉淀：线粒体，膜受体体，膜受体上清液上清液10,000300,000g, 1015 min沉淀：微沉淀：微粒体粒体上清液：上清液：浆受体浆受体10,000300,000g, 1015 min受体分析检查检验核医学302、放射标记配基、放射标记配基1 1）高亲和力、高特异性）高亲和力、高特异性2 2）高稳定性）高稳定性3 3）高比活度）高比活度4 4）高放化纯）高放化纯受体分析检查检验核医学313 3、非标记配基、非标记配基v用来设立用来设立NSB，可以与标记配基同一物质，可以与标记配基同一物质，也可不同，但必须与受体结合

16、有高亲和力。也可不同，但必须与受体结合有高亲和力。受体分析检查检验核医学32（二）温育条件（二）温育条件v1、缓冲液、缓冲液 v2、时间与温度、时间与温度 受体分析检查检验核医学33（三）分离（三）分离v分离的目的是分离的目的是将将已形成的已形成的放射性复合物与游放射性复合物与游离的放射性配体分开离的放射性配体分开，测定其复合物放射性。，测定其复合物放射性。一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在一旦分离，原有的反应平衡被破坏，因此在分离过程中要使复合物的解离降低到最低程分离过程中要使复合物的解离降低到最低程度，度，低温低温和和快速快速是最有效的措施。是最有效的措施。v常用的分离方法有常用的分离

17、方法有：v1、平衡透析法；平衡透析法；v2、离心法、离心法v3、过滤法、过滤法 受体分析检查检验核医学34六、定量六、定量RBA的数据处理的数据处理 v定量定量RBA主要是通过测得的样品的主要是通过测得的样品的数据及所用标记配体的量和比活度，数据及所用标记配体的量和比活度，通过数学模型进行运算，得出受体通过数学模型进行运算，得出受体的有关参数的有关参数RT、KD等。等。受体分析检查检验核医学351、单点法、单点法v仅取一个浓度点的标记配体，标记配体的量仅取一个浓度点的标记配体，标记配体的量可使受体饱和并略有剩余（过量）。可使受体饱和并略有剩余（过量）。v该法操作简便，标本用量少，但只能给出受该

18、法操作简便，标本用量少，但只能给出受体的最大结合位点数（体的最大结合位点数（RT），无法得了该配），无法得了该配体与受体的亲和力（体与受体的亲和力（KD）。）。受体分析检查检验核医学36单点法单点法RBARBA的数据处理的数据处理v(1)从实验所得到的总结合从实验所得到的总结合TB减去非特异性结减去非特异性结合合NSB的平均放射性计数（的平均放射性计数（cpm）得到特异）得到特异性结合性结合RL的的cpm。v(2)根据仪器测量效率将根据仪器测量效率将RL的的cpm换算成换算成dpm, 用配体的比活度再换算成用配体的比活度再换算成mol。v(3)受体与配体的结合按受体与配体的结合按1：1形成复合

19、物，则形成复合物，则RL的的mol即为受体结合位点的即为受体结合位点的mol数。数。受体分析检查检验核医学37v(4)另取一定量的样品测蛋白含量或细胞另取一定量的样品测蛋白含量或细胞数，即可算成一定量蛋白或一定细胞数数，即可算成一定量蛋白或一定细胞数中中RT的的mol数数,即为即为RT。v(5)还可进一步将还可进一步将mol换算成分子数（换算成分子数（1 mol=6.021023个分子），从而得到单个分子），从而得到单位细胞或单位蛋白的受体结合位点数。位细胞或单位蛋白的受体结合位点数。受体分析检查检验核医学38此式中受体与配体为此式中受体与配体为1：1关系，如受体与配关系，如受体与配体以体以1

20、：2关系形成复合物，则上式应被关系形成复合物，则上式应被2除。除。对于完整细胞，则按细胞数进行计算，以对于完整细胞，则按细胞数进行计算，以mol/106细胞或受体位点数细胞或受体位点数/106细胞表示。细胞表示。 )%molcpmRLRT标本蛋白量（配基比活度）测量效率（的受体分析检查检验核医学39例例v实验室进行外周血实验室进行外周血WBC的的GCR分析，测得分析，测得TB为为4500cpm，NSB为为2500cpm，3H-Dex的的SA为为1.851012Bq/mmol，蛋白量为，蛋白量为1mg，液闪的，液闪的Eff=30%vSB=TB-NSB=4500-2500=2000cpmv2000

21、/（0.3601.8510121）=60fmol/mg)%molcpmRLRT标本蛋白量（配基比活度）测量效率（的受体分析检查检验核医学40v1mol=6.021023分子分子v60fmol/mg= 6010-156.021023=3.61010受体受体/mg蛋白蛋白若：若：WBC细胞数为细胞数为7.5106个，则个，则RT=3.61010/ 7.5106=4800受体受体/细胞细胞受体分析检查检验核医学412、多点法、多点法v多点法实验可分简单多点法实验可分简单单位点单位点和和双（多）位点双（多）位点两部分。常用多点饱和曲线法：即每一受体两部分。常用多点饱和曲线法：即每一受体标本做标本做68

22、8个标记配体浓度点（多位点所需个标记配体浓度点（多位点所需浓度点更多），标记配体的用量应覆盖受体浓度点更多），标记配体的用量应覆盖受体的饱和区和不饱和曲，以得到饱和曲线。的饱和区和不饱和曲，以得到饱和曲线。v数据处理是将数学模型直线化数据处理是将数学模型直线化，再将测得数，再将测得数据进行直线拟合，求出所需参数。计算机普据进行直线拟合，求出所需参数。计算机普及后，人们用计算机进行曲线拟合，以减少及后，人们用计算机进行曲线拟合，以减少直线化带来的误差。直线化带来的误差。受体分析检查检验核医学42vScatchardScatchard作图作图v简单单位点系统在Scatchard作图中应呈一条直线。

23、v以RL/L对RL作图，即为Scatchard作图。在简单单位点系统，应得一直线。斜率是 -1/KD，而直线与横轴的交点则等于RT值。 RLKDKDRTLRL1受体分析检查检验核医学43RLKDKDRTLRL1受体分析检查检验核医学44v例：例： 实验室做外周血实验室做外周血WBC的的GCR多点分析，多点分析，3H-Dex的的SA为为38.0Ci/mmol，放化纯为，放化纯为99%，配成工作浓度，配成工作浓度10uCi/ml.受体分析检查检验核医学451 1、加样程序、加样程序WBC/GCR 3H-DexWBC/GCR 3H-Dex多点多点RBARBA编号编号3H-DexDex(ul)PBS补

24、足体补足体积积ul细胞细胞ululnMTB1104.3890500NSB1104.38585500TB2208.7780500NSB2TB32510.9575500NSB32510.9512.562.5500TB43013.1670500NSB4TB54017.5460500NSB54017.541540500TB65021.9350500NSB65021.932525500受体分析检查检验核医学462 2、测量结果、测量结果WBC/GCR 3H-DexWBC/GCR 3H-Dex多点多点RBARBA测量结果测量结果编号编号3H-Dex（ul)TB（cpm） NSB（cpm）T(cpm)110

25、178656914453022027992890603253322137536132543036274335905404235211757812065047402690722650受体分析检查检验核医学473 3、建立、建立NSBNSB的回归方程的回归方程v以以NSB管的管的cpm对对3H-Dex的体积数（的体积数（10、20、25、3040、50）建立回归方程，得到：）建立回归方程，得到： Y=52.5456X+45.7007（r=0.9997） 将未做的将未做的NSB管对应的管对应的3H-Dex体积（体积（20、40）代入方程，得到代入方程，得到NSB各管值。各管值。 （10、571）；（

26、）；（20、1097）；（）；（25、1359）；）；（30、1622）；（）；（40、2148）；（）；（50、2673）受体分析检查检验核医学484、计算、计算B、F和和B/F3H-Dex（ul)SB（cpm）F（cpm）B/F1012151427440.0085122017022862610.0059462519633580030.0054833020054299630.0046634020875738850.0036375020677179100.002879受体分析检查检验核医学495、换算、换算B相对应的相对应的3H-Dex 物质量物质量 比放比放= SA为为38.0Ci/mmol，