老鼠{对四氯化碳性致肝纤维化大鼠的治疗机制研究

1、老鼠?对四氯化碳性致肝纤维化大鼠的治疗机制研究                       作者：梅燕 林军  侯软玲 刘林【摘要】  目的研究老鼠?对CCl4诱导的大鼠肝纤维化肝组织肿瘤坏死因子（TNF-）、转化生长因子1（TGF1）与Smad3 mRNA表达的影响。方法Wistar大鼠随机分成5组：空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组、老鼠?乙醇浸膏低剂量

2、组和老鼠?乙醇浸膏高剂量组。除空白对照组外，其余4组用CCl4制备大鼠肝纤维化模型。秋水仙碱组、老鼠?乙醇浸膏低剂量组和老鼠?乙醇浸膏高剂量组分别于4周后给予相应的药物，空白对照组给予等容量的生理盐水，1次/d。8周后处死大鼠，RT-PCR检测肝组织中TNF-，TGF1 与Smad3 mRNA的表达。论文学术科研网结果与空白对照组相比，模型对照组TNF-，TGF1 与Smad3 mRNA表达增强（0.23±0.18vs0.49±0.28，0.29±0.16vs1.79±2.13, 0.52±0.36vs0.99±0.53，P<0

3、.01）；老鼠?乙醇浸膏高、低剂量组（2.0，1.0 g?kg-1）较模型对照组TNF-，TGF1 与Smad3 mRNA表达减弱（1.0 g?kg-1：0.29±0.21vs0.49±0.28，0.62±0.44vs1.79±2.13, 0.59±0.34vs0.99±0.53，P<0.05；2.0 g?kg-1：0.16±0.13vs0.49±0.28，0.66±0.51vs1.79±2.13, 0.53±0.41vs0.99±0.53，P<0.05）。结论老

4、鼠?能够抑制大鼠肝纤维化肝组织TNF-，TGF1 与Smad3mRNA的表达。 【关键词】  肝纤维化 老鼠? 肿瘤坏死因子 转化生长因子1 Smad3老鼠?Acanthus ilicifolius Linnseus是一种生长在热带海岸地带的红树林植物，属爵床科（Acanthaceae）老鼠?属Acanthus。老鼠?收录于全国中草药汇编，全株或根入药，具有清热解毒、消肿散结、止咳平喘之功效，主治淋巴结肿大、急慢性肝炎、肝脾肿大、胃痛、咳嗽、哮喘1。    肝纤维化的形成机制是细胞外基质（ECM）的合成和降解失调。肿瘤坏死因子（TNF-）在肝纤维化始动激

5、活及调控中具有重要作用；转化生长因子1（TGF1）是导致肝纤维化的最重要的细胞因子, 其作用的发挥和细胞内信号转导蛋白Smad 密切相关。其中，Smad3是介导TGF1诱导肝纤维化的关键分子。本实验观察老鼠?治疗大鼠实验性肝纤维化的疗效，研究大鼠肝组织TNF-、TGF1 与Smad3 mRNA的表达情况，探讨老鼠?对大鼠肝纤维化的治疗机制。1  材料1.1  动物清洁级Wistar大鼠60只，体重（180±20） g，由广西医科大学实验动物中心提供。1.2  药品及配制老鼠?乙醇浸膏由本课题实验组提取。取100 g老鼠?乙醇浸膏，用单蒸水配制成高剂量浓度

6、为0.2 g（相当于生药材46.60 g）?ml-1的药液；取50 g老鼠?乙醇浸膏，用单蒸水配制成低剂量浓度为0.1 g?ml-1的药液。 -4保存备用，使用前摇匀；秋水仙碱（西双版纳股份药业有限责任公司，批号：060717），用单蒸水配制成浓度为0.040 mg?ml-1的药液。1.3  试剂四氯化碳（上海化学试剂公司，批号20050393）。Trizol总RNA提取试剂盒（美国Invitrogen）；RT-PCR逆转录试剂盒（美国Fermentas）；无水乙醇（成都市科龙化工试剂厂，批号20070126）；三氯甲烷（重庆川江化学试剂厂，批号20070507），异丙醇（成都市科龙

7、化工试剂厂，批号20070418）。2  方法2.1  建立大鼠肝纤维化模型2及给药方法60只Wistar大鼠随机分为5组：空白对照组、模型对照组、秋水仙碱组、老鼠?乙醇浸膏高剂量组和老鼠?乙醇浸膏低剂量组。每组12只。除了空白对照组外，其余各组大鼠第1次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.05 ml?kg-1，以后每周2次皮下注射40%CCl4植物油溶液0.03 ml?kg-1。空白对照组仅皮下注射等体积植物油。连续8周。在注射四氯化碳4周后，秋水仙碱组以0.4 mg?kg-1、老鼠?乙醇浸膏高、低剂量组分别以2.0，1.0 g?kg-1，用等容量给药法按10 ml?kg

8、-1灌胃，1次/d。空白对照组和模型对照组给予等容量的生理盐水。连续4周。2.2  标本采集所有大鼠于第8周末处死，取肝左叶组织1块，于-70保存。2.3  肝组织TNF-、TGF1 与Smad3 mRNA的表达测定Trizol提取大鼠肝组织总RNA，方法按试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计测定RNA纯度，按RT-PCR逆转录试剂盒说明把mRNA逆转录成cDNA。RT-PCR分析TNF-、TGF1 与Smad3，-actin作为内参。TNF-、TGF1 、Smad3和-actin引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。TNF-上游引物序列：5TGCCTCAGCCTCTT

9、CTCATT 3，下游引物序列： 5TGGTATGAAGTGGCAAATCG 3，扩增产物长度为404bp；TGF1上游引物序列：5TACAGGGCTTTCGCTTCAGT 3，下游引物序列： 5TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC 3，扩增产物长度为394bp；Smad3上游引物序列：5GCAGTGGCAATCACAGAGAA 3，下游引物序列： 5AACAGCCTGGGAGAGACTCA 3，扩增产物长度为386bp；-actin上游引物序列：5AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG 3，下游引物序列： 5TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT 3，扩增产物长度为240b

10、p。取5g总RNA按逆转录试剂盒说明书逆转成cDNA。以cDNA为模板分别按以下条件PCR反应扩增TNF、TGF1 和Smad3片断。TNF- PCR条件：94 4min 30s，9430s，5230s，72 1 min，30个循环，72 8 min；TGF1 PCR条件：94 4 min 30 s，9430 s，55 30 s，72 1 min，30个循环，72 8 min；Smad3 PCR条件：94 4 min30 s，94 30 s，53 30 s，72 1 min，30个循环，72 8 min。取5 l PCR产物，在2%琼脂糖凝胶（含溴乙啶）上电泳，电泳条件：120V，20min，

11、凝胶电泳成像分析系统采集图像。以内参-actin为基准作半定量分析，以扩增目的基因区带的灰度值与内参-actin区带的灰度值之比确定各扩增目的基因的相对表达水平。2.4  统计学方法用SPSS13.0软件分析，计量资料用±s表示，多样本均数采用方差分析。P0.05表示差异有显著性意义。3  结果3.1  肝组织总RNA的提取提取的总RNA通过测定OD260/OD280比值均介于1.72.0之间，表明各样品RNA纯度符合实验要求。经1%琼脂糖凝胶电泳紫外灯下观察，未见RNA明显降解。 学术科研网3.2  肝组织TNF-、TGF1 与Sm

12、ad3 mRNA的表达大鼠肝组织TNF- mRNA、TGF1mRNA、Smad3 mRNA均表达，见图13。从表1可知，大鼠模型对照组与空白对照组的TNF-，TGF1 、Smad3 mRNA表达水平差异有显著性（P0.01），表明TNF-，TGF1 、Smad3在肝纤维化大鼠肝脏大量表达；秋水仙碱组、老鼠?乙醇浸膏高剂量组、老鼠?乙醇浸膏低剂量组分别与模型对照组相比，差异有显著性（P0.05），表明TNF-，TGF1 ，Smad3在各组中的表达均较模型对照组有所降低。图1  肝组织TNF- mRNA的表达（略） 图2  肝组织TGF1mRNA的表达（略）图3

13、60; 肝组织Smad3 mRNA的表达（略）表1  老鼠?对肝纤维化大鼠肝脏TNF mRNA，TGF1 mRNA和Smad3 mRNA表达的影响（略）与空白对照组比较，*P<0.05，*P<0.01；与模型组比较，P<0.05,P<0.01；n=124  讨论    肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的必经阶段，其主要机制是细胞外基质合成与降解失调。肝星状细胞（HSC）是肝纤维化发生发展的关键细胞，有多种细胞因子对HSC具有激活、增生及转化的作用。    在肝纤维化过程中TNF-对HSC的

14、增殖、活化以及ECM的合成、基质金属蛋白酶及其组织抑制剂的释放起重要作用。TNF能上调活化的HSC中蛋白水解酶抑制物的合成，从而抑制基质的降解3。作为炎性细胞因子，TNF-刺激枯否细胞释放更多的细胞因子如TGF1等，形成正反馈的放大作用，产生更多的ECM4。TNF-主要是通过刺激肝脏炎症反应的产生而发挥其促纤维化作用5。TNF-与肝纤维化有关的作用包括： 诱发急性炎症过程；加强HSC的趋化性； 刺激间质细胞有丝分裂； 诱发蛋白多糖的合成。    研究表明ECM的合成与降解很大程度上由TGF1控制，TGF1突出作用是促进胶原与细胞外基质的形成，同时抑制其胶原酶的降解

15、。在TGF1作用下，HSC被激活或转化为肌成纤维细胞6。激活的HSC自身也合成、分泌TGF1，HSC在自分泌和旁分泌的TGF1作用下大量活化，这种自分泌正反馈调节是肝纤维化得以发展的重要环节7。TGF1 对HSC 的活化信号必须经过细胞膜相应受体及其下游效应分子如Smad 蛋白,启动HSC细胞内信号传导系统。Smad蛋白是目前发现的TGF家族受体激酶的关键作用底物8,是将配体与受体作用的信号由胞浆传导到胞核的中介分子。Schnabl 等9报道，在肝纤维化发生发展的分子机制中,有Smad蛋白的参与, 以Smad3 为代表的R-Smad分子传递的可能是致肝纤维化信号。Smad3是介导TGF-1诱导

16、肝纤维化的关键分子。TGF-1激活的肝星状细胞主要表达Smad310。本研究显示在肝纤维化模型组，Smad3表达升高，随着用药组的治疗，Smad3表达减弱，表明Smad3参与调节胶原的转录。    本实验研究结果显示，老鼠?乙醇浸膏能抑制TNF-，TGF1 与Smad3 mRNA转录，抑制HSC活化，促进细胞外基质的降解，减弱肝纤维化的程度。提示老鼠?乙醇浸膏可通过发挥对细胞因子TNF，TGF1 与Smad3的影响，减少由于CCl4染毒而导致肝内胶原产生和沉积，在多个环节抑制肝纤维化的形成，从而为老鼠?防治肝纤维化提供了一定的实验依据。【参考文献】  1

17、 全国中草药汇编编写组. 全国中草药汇编，下册M. 北京：人民卫生出版社，1978：231.2 徐叔云，卞如濂，陈 修药理实验方法学，第3版M北京：人民卫生出版社，2002：1350.3 Knittel L, Tmehde M, Kobold D, et a1. Expression patterns of matrix metalloproteinase- es and their inhibitors in parenchymal and nonparencymal cells of rat liver：regulation by TNF-alpha and TGF-beta 1J. J

18、Hepatol, 1999, 30: 48.4 陈晓红, 何有成, 周元平. TGF1 、TNF-及IL-6与肝纤维化的关系J. 上海免疫学杂志, 2001, 21(6): 364.5 Lee KS, Buck M, Houglum K, et a1Activation of hepatic stellate cells by TNF- and collagen type I is mediated by oxidative stress through c-myb expressionJ. J Clin Invest, 1995, 96: 620.6 Bodes P, Parades V. Transforming growth factor-1; a keyrole in liver fibrogenesisJ. J Hepatol 1995, 22(suppl 2): 37.7 张保伟, 李爱峰, 赵志敏. 乌梅丸对免疫损伤性肝纤维化