高效液相色谱_串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸

1、高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸丁敏*1叶炼1王猛1邵勇21(重庆医科大学医学检验系,临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室,重庆4000162(重庆医科大学附属第一医院妇产科,重庆400016摘 要 建立了高效液相色谱-串联质谱同时测定血清中游离和结合型胆汁酸的方法。血清样品经固相萃取后,在C 18色谱柱上梯度洗脱,用负离子多反应监测模式检测。15种胆汁酸在0.10100.0 mo l/L 的浓度范围内与响应呈良好的线性,r 为0.99900.9999;检出限为0.0010.006 mo l/L ;本方法的相对标准偏差日内不超过3.0%,日间不超过6.0%;平均回收率

2、为86.0%110.0%,适合于临床检测血清胆汁酸。关键词 胆汁酸,血清,高效液相色谱,串联质谱2007-02-25收稿;2007-05-14接受本文系国家自然科学基金资助项目(No .20475069*E-m ai:l d i ng m i n63yahoo .co 1 引 言胆汁酸与肝胆系统疾病以及能引起胆汁酸代谢异常的其它疾病都有着密切的关系,且在不同疾病时各胆汁酸的变化趋势和程度均不相同1,2。目前,血液中胆汁酸的分类检测方法主要有高效液相色谱法(H PLC3、气相色谱/质谱法(GC /M S4和H PLC -M S /M S 法5等。GC -M S 法需对胆汁酸按类别进行水解和衍生,

3、H PLC 法也需进行荧光衍生,且牛磺结合型胆汁酸还需水解后再衍生,而HPLC -M S /M S 法灵敏、特异,可同时测定血清中各型胆汁酸。本研究建立了同时检测血清中游离、甘氨和牛磺结合型胆汁酸的HPLC -M S /M S 方法,并用于正常孕妇、妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis o f pregnancy ,I CP患者和伴有乙型肝炎的I CP 患者血清胆汁酸的检测,取得满意的结果。2 实验部分2.1 仪器与试剂离子化模式:ESI -;聚焦电压:-300V;射入电压:-10V;停顿时间:5.00m s ;离子源气帘气:20.0mL /m i n ;喷雾

4、电压:-4200V;温度:200 ;碰撞气20.0mL /m i n 。多反应监测(MR M ,监测离子第35卷2007年10月分析化学(FENX I HUAXU E 研究简报Ch i nese Journa l o f Ana l y ti ca l Chem istry第10期15061508对见表1。2.4 色谱条件柱温:25 ;流速:1mL /m in ;分流比为1 4;流动相A:5mm ol/L 醋酸铵和0.01%甲酸水溶液;B :5mm o l/L 醋酸铵和0.01%甲酸甲醇溶液。梯度洗脱程序为:0m in(80.0%B9m i n (97.0%B 10m i n (80.0%B

5、15m i n (80.0%B。3 结果与讨论3.1 流动相梯度的确定实验结果表明,固相萃取法的回收率优于蛋白沉淀法。采用不同比例的甲醇、乙腈和水等混合溶剂作为流动相,以甲醇-水为流动相时质谱仪响应信号较强。但对胆汁酸仅以甲醇-水为流动相不能实 图1 15种胆汁酸混合标准品的M RM 色谱图F i g .1 M RM chroma tog ram of 15standard bile ac i ds现基线分离。为此考察在流动相中加入一定量的甲酸、三氟乙酸、醋酸铵后的分离效果,甲醇和水中都加入甲酸和醋酸铵后,具有较高的灵敏度和分离度,但酸度过高会抑制胆汁酸的离子化。以5mm o l/L 醋酸铵和

6、0.01%的甲酸最优。采用梯度洗脱可缩短分析时间,改善峰性,同时确保母离子/子离子相同的胆汁酸尽可能实现基线分离,15种胆汁酸标准混合溶液的色谱图见图1。3.2 方法的精密度和回收率在血清中加入适量胆汁酸标准品混合液,日内重复测定5次,连续测定5d ,相对标准偏差日内在0.7%3.0%之间,日间在1.3%5.9%之间。对血清样品进行高、低两种浓度的回收率实验,重复测定5次,胆汁酸的平均回收率高浓度(10.0 m ol/L为90.5%105.7%,低浓度(0 50 mo l/L为86 0%110.0%。3.3 标准曲线和检出限用正常人血清配制不同浓度的胆汁酸标准混合液,重复测定3次。用胆汁酸标准

7、混合液中各胆汁酸的峰面积,减去血清中相应的内源性胆汁酸的峰面积对胆汁酸浓度绘制标准曲线,各胆汁酸在0.10100 m o l/L 浓度范围内线性良好。以S /N =3时胆汁酸的浓度为检出限,结果见表1。表1 胆汁酸的多反应监测离子对、标准曲线、相关系数和检出限T able 1 M RM channe,l standard cu rves ,correlati on coeffic i ents and li m it o f de tecti on (LOD o f b ile ac i ds胆汁酸B il e aci ds监测离子对M R M channel (Q1/Q3,m /z 标准曲线

8、y =ax +b a b 相关系数检出限LOD ( m ol/L胆酸Choli c aci d ,CA41193498.4/79.92.92 1032780.99960.0031507第10期丁敏等:高效液相色谱-串联质谱法同时测定血清中游离和结合型胆汁酸3.4 实际样品的测定采用本方法分别测定了正常孕妇、I CP 患者和I CP 伴有乙型肝炎患者各5例的血清胆汁酸(见图2和图3,这3组的血清胆汁酸谱有明显差异,将有助于I C P 的诊断和鉴别诊断。图2 妊娠期肝内胆汁淤积症患者血清胆汁酸的M RM 色谱图F ig .2 M R M chro m atog ra m of b ile ac i

9、 ds i n a seru m sam -p l e fro m a patient w ith i ntrahepatic cho lestas i s o f pregnancy ( ICP图3 3组15种胆汁酸的浓度( X S D, mo l/L,n =5F i g .3 Concentration of 15bil e acids for t he three group (mean SD , m o l/L,n =5:正常孕妇(healt hy pregnan ci es;:妊娠期肝内胆汁淤积症患者(I CP;:ICP 伴有乙型肝炎患者(ICP w it h HBV .R efer

10、ences1 Y ouse f I M,Pe r w aiz S ,Lam ireau T,Tuchw eber B .M ed .Sci .M onit ,2003,9(3:21312 S j va ll J .L i p i d s ,2004,39(8:7037223 D i ng M in (丁 敏,L iu Chun -F ang(刘春芳,H e Jun(何 俊.J ournal of A nal y tical Science (分析科学学报,2004,20(5:4924944 M eng L J ,Sjovall J .J.Chromatog r .B ,1997,688(1:1

11、126Simultaneous Deter m ination of Free andConjugated B il e Acids i n Seru m by H i gh Perfor m ance L i qui dChro matography -Tande m M ass Spectro m etryD i ng M in *1,Y e L ian 1,W ang M eng 1,Shao Y ong 21(D e p ar t m ent of Laboratory M edicine ,K ey Laboratory of C linical Laboratory D i agn

12、ostics ,M i nistry of Education,Chongq i ng M e d ical U ni ver sity,Chongqing 4000162(D epart m ent of O b stetr ics and Gynecolog,t he F istA ff iliate d H o s p ital of Chongqing M edical Universit y,Chongq i ng 400016Abst ract A m ethod has been developed for the deter m i n ati o n of i n div i

13、 d ual free and con j u gated bile acids by li q u i d chro m atography tende m m ass spectro m etry (H PLC -M S /MS .B ile aci d s w ere extracted fro m ser umsa m ples using cartridges and eluted usi n g gradient on a C 18colu m n .E lectr ospray ion isati o n (ESIw as perfor m ed i n the negative

14、 i o n m ode .The e l u tions were monito red i n mu ltiple reacti o n-m onitori n g m ode .The li n ear ranges of the m ethod were 0.10-100.0 m ol/L w ith the correlation coeffients fr o m 0.9990to 0.9999for all b ile ac i d s .The detecti o n li m it ranged fr o m 0.001to 0.006 mo l/L .The i n tra -day precisi o ns w ere belo w 3 0%and the i n ter -day precisions w ere belo w 6.0%for all bile .The average recoveries of the extracti o n pr oce -dure w ere bet w een 86.0%and 110.0%.The deve l o ped m ethod w a