第9章吸光光度法(2)

1、第九章第九章 吸吸 光光 光光 度度 法法Spectrophoto metry吸光光度法基本原理吸光光度法基本原理光度计及其基本部件光度计及其基本部件显色反应及显色条件的选择显色反应及显色条件的选择吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择问题思考：问题思考：1 1、显色反应如何选择？显色反应如何选择？2 2、吸光度测量条件如何选择？吸光度测量条件如何选择？3 3、光度分析法中，参比溶液如何选择？光度分析法中，参比溶液如何选择？4 4、什么是标准曲线？它有何实际意义？什么是标准曲线？它有何实际意义？一、显色反应一、显色反应9-3 9-3 显色反应与显色条件的选择显色反应与显色条件的选择显色反应显

2、色反应没有颜色的化合物，需要通过适当的反没有颜色的化合物，需要通过适当的反 应定量生成有色化合物再测定。应定量生成有色化合物再测定。M(待测组分待测组分) + nR(显色剂显色剂) = MRn(有色化合物有色化合物)显色剂（显色剂（R R）：）：无机显色剂和有机显色剂。无机显色剂和有机显色剂。1.1.无机显色剂：无机显色剂：如如 NH3、CN- 等等 由于生成的络合物不够稳定，且灵敏度不高和分步络由于生成的络合物不够稳定，且灵敏度不高和分步络合等原因而应用不多。到目前为止，可用的无机显色剂仅合等原因而应用不多。到目前为止，可用的无机显色剂仅有硫氰酸盐、钼酸铵和过氧化氢等。有硫氰酸盐、钼酸铵和过

3、氧化氢等。2.2.有机显色剂有机显色剂 有机显色剂分子中含有某些含不饱和键的基有机显色剂分子中含有某些含不饱和键的基团 如 偶 氮 基 、 对 醌 基 和 羰 基 等 生 色 团团 如 偶 氮 基 、 对 醌 基 和 羰 基 等 生 色 团 （chromophoric group）和含孤对电子的基团如氨）和含孤对电子的基团如氨基、羟基和卤代基等助色团（基、羟基和卤代基等助色团（auxochrome group）。）。：助色团助色团NH，OH，X （孤对电子）（孤对电子）neO生色团生色团：NN，NO，OC=S,N （共轭双键）（共轭双键）e有机显色剂有机显色剂CH3CCCH3 HON NOH

4、NNOHCOOHSO3HOO型：型：NH NHNSNS型型：双硫腙双硫腙 测定测定Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cd2+NN型：型：丁二酮肟丁二酮肟用于测定用于测定Ni2+邻二氮菲邻二氮菲测微量测微量Fe2+磺基水杨酸磺基水杨酸 主要用于测主要用于测Fe3+b. 离子缔合反应离子缔合反应CCOOHNN(C H )22 5(C H )22 5H+O-AuCl4.罗丹明罗丹明B 例如：钢中微量锰的测定。将例如：钢中微量锰的测定。将Mn2 氧化成紫红色的氧化成紫红色的 MnO4-后在后在525 nm处进行测定。处进行测定。2 Mn2 5 S2O82-8 H2O =2 MnO4- + 10 SO42-

5、 16H+ c. 氧化还原反应氧化还原反应a. 配合反应配合反应3. 显色反应类型显色反应类型NNF e2 +3 显色反应的要求？显色反应的要求？（1 1）选择性好选择性好，干扰少或干扰易消除，（专一性好），干扰少或干扰易消除，（专一性好）（2 2）灵敏度高灵敏度高（大于大于10104 4）（3 3）反应生成的有色化合物组成）反应生成的有色化合物组成恒定恒定（4 4）有色化合物化学性质足够）有色化合物化学性质足够稳定稳定（5） 有色化合物与显色剂之间的颜色差别较大，显有色化合物与显色剂之间的颜色差别较大，显色剂在测定波长处无明显吸收，色剂在测定波长处无明显吸收，对比度对比度60nm。 MRRm

6、axmax-60nm二、二、 显色条件的选择显色条件的选择 显色条件包括显色条件包括: 溶液酸度，显色剂用量，显溶液酸度，显色剂用量，显色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存色时间，显色温度，有机络合物的稳定性及共存离子的干扰等。离子的干扰等。 吸光光度法是测定待测物质的吸光度或显色吸光光度法是测定待测物质的吸光度或显色反应平衡后溶液的吸光度，因此为了得到准确的反应平衡后溶液的吸光度，因此为了得到准确的结果，必须控制适当的条件，使显色反应完全和结果，必须控制适当的条件，使显色反应完全和稳定。稳定。1 1、溶液酸度（、溶液酸度（pHpH值及缓冲溶液）值及缓冲溶液） M + nR = MRnO

7、H-H+例：磺基水杨酸例：磺基水杨酸 Fe 3+pH = 2 3FeR紫红色紫红色pH = 4 7FeR2橙色橙色pH = 8 10FeR3黄色黄色 (1) 影响显色剂的平衡浓度和颜色影响显色剂的平衡浓度和颜色不能过高；不能过高； (2) 影响被测金属离子的存在状态影响被测金属离子的存在状态不能过低；不能过低； (3) 影响有色化合物的组成。影响有色化合物的组成。pH1pHpH2pH 酸度的选择酸度的选择（cM、 cR等条件固定）等条件固定） 溶液的酸度一般用缓冲溶液来控制。溶液的酸度一般用缓冲溶液来控制。c(R)c(R)2、显色剂用量、显色剂用量（cM、pH等等条件固定）条件固定）M + R

8、 M RR应稍过量，选择曲线变化平坦处。应稍过量，选择曲线变化平坦处。3 3、显色温度、显色温度实际工作中，作实际工作中，作 A A T T 曲线，寻找适宜反应温度。曲线，寻找适宜反应温度。ATATATAT加热可加快反应速度，但有可能导致显色剂或产物分解。加热可加快反应速度，但有可能导致显色剂或产物分解。(c(M)、 c(R) 、 pH一定一定)4 4、显色时间、显色时间T1()T2()t(min)A实际工作中，作实际工作中，作A A t t 曲线，寻找适宜反应时间。曲线，寻找适宜反应时间。t(min)A(c(M)、 c(R) 、 pH一定一定)5 5、溶剂、溶剂有机溶剂降低有色化合物的解离度

9、，提高显色反应的有机溶剂降低有色化合物的解离度，提高显色反应的灵敏度。如在灵敏度。如在Fe(SCN)3的溶液中加入丙酮，能降低的溶液中加入丙酮，能降低有色化合物的解离度，使配合物颜色加深。有机溶剂有色化合物的解离度，使配合物颜色加深。有机溶剂还可能提高显色反应的速率，影响有色配合物的溶解还可能提高显色反应的速率，影响有色配合物的溶解度和组成等。度和组成等。 6 6、干扰及其消除方法、干扰及其消除方法 试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。试样中存在干扰物质会影响被测组分的测定。例如：例如： 干扰物质本身有颜色干扰物质本身有颜色，在测量条件下也有吸收。，在测量条件下也有吸收。 干扰物质与被测组

10、分反应或与显色剂反应干扰物质与被测组分反应或与显色剂反应，使显色反应不，使显色反应不 完全。完全。 干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊干扰物质在测量条件下从溶液中析出，便溶液变混浊，无，无 法准确测定溶液的吸光度。法准确测定溶液的吸光度。为消除以上原因引起的干扰，为消除以上原因引起的干扰，可采取什么方法？可采取什么方法？例：例：测测CoCo2 2( (含含FeFe3+3+) )b) b) 加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂加入配位掩蔽剂或氧化还原掩蔽剂 a) a) 控制溶液的酸度控制溶液的酸度 例：例：测测FeFe3 3 Fe3+, Cu2+FeSSal （紫红）（紫红）Cu2+pH

11、2.5SSalCo2+, Fe3+Co2+FeF63-Co(SCN)2 (蓝蓝)NaFSCNCo2+Fe2+,Sn4+(2)Sn2+Co(SCN)2SCNc. 利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态利用氧化还原反应，改变干扰离子的价态 d. 用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。用参比溶液消除显色剂和某些共存有色离子的干扰。e. 选择适当的波长选择适当的波长f. 当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加当溶液中存在有消耗显色剂的干扰离子时，可通过增加显色剂的用量来消除干扰。显色剂的用量来消除干扰。g. 采用预先分离的方法。采用预先分离的方法。三、三元配合物在光度分析中的应用特性简

12、介（三、三元配合物在光度分析中的应用特性简介（自学自学） 由一种金属离子同时与两种不同的配位体形成的三元配由一种金属离子同时与两种不同的配位体形成的三元配合物具有下列分析特性：合物具有下列分析特性：1 1、稳定，可提高分析测定的准确度和重现性、稳定，可提高分析测定的准确度和重现性 例例: Ti-EDTA-H2O2三元配合物的稳定性，三元配合物的稳定性，比比Ti-EDTA和和Ti-H2O2二元配合物的稳定性，分别增强约二元配合物的稳定性，分别增强约1000倍和倍和100倍。倍。2 2、比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度、比二元配合物具有更高的灵敏度和更大的对比度 灵敏度通常可提高灵敏度通

13、常可提高1 1至至2 2倍，有时甚至提高倍，有时甚至提高5 5倍以上。倍以上。3 3、比二元体系具有更高的选择性、比二元体系具有更高的选择性 减少了金属离子形成类似配合物的可能性。减少了金属离子形成类似配合物的可能性。9-4 9-4 吸光度测量条件的选择吸光度测量条件的选择一、一、入射光波长的选择入射光波长的选择一般一般选择选择 max为测定波长为测定波长, 为什么为什么?如果在如果在 max处处有共存组分的有共存组分的干扰干扰，如何选择测定波长如何选择测定波长?A 选既避开干扰选既避开干扰,又使吸收尽可能大的又使吸收尽可能大的，选择原则：选择原则：“吸收最大，干扰最小吸收最大，干扰最小”。在

14、选定了显色反应并确定了最佳显色反应条件后在选定了显色反应并确定了最佳显色反应条件后, 用仪器测吸光度时应选择合适的测量条件。用仪器测吸光度时应选择合适的测量条件。其包括以下几方面其包括以下几方面:不仅灵敏度高，不仅灵敏度高，而且能够减少或消除由非单色光而且能够减少或消除由非单色光引起的对朗伯比耳定律的偏离。引起的对朗伯比耳定律的偏离。A 例例: 丁二酮肟光度法测钢中镍，丁二酮肟光度法测钢中镍，配合物配合物丁二酮肟镍丁二酮肟镍的最大吸收的最大吸收波长为波长为470 nm，但试样中的，但试样中的铁铁用酒石酸钠掩蔽后，在用酒石酸钠掩蔽后，在470 nm处也有一定吸收，干扰镍的测处也有一定吸收，干扰镍

15、的测定。定。 为避免铁的干扰，可以选择波为避免铁的干扰，可以选择波长长 520 nm进行测定，虽然而测镍的进行测定，虽然而测镍的灵敏度有所降低，但灵敏度有所降低，但酒石酸铁酒石酸铁不干不干扰镍的测定。扰镍的测定。二、参比溶液的选择二、参比溶液的选择为什么要使用参比溶液？为什么要使用参比溶液？ 如何选择参比溶液如何选择参比溶液? 目的目的 测定时，采用两个材质、厚度相同的比色皿进行测量，其中测定时，采用两个材质、厚度相同的比色皿进行测量，其中一个作为参比池，装入参比溶液，调节仪器使透过参比池的吸光一个作为参比池，装入参比溶液，调节仪器使透过参比池的吸光度为零。则测得待测溶液的吸光度为：度为零。则

16、测得待测溶液的吸光度为： A=lgI0/I=lgI参比参比/I试液试液 即即以通过参比池的光强度作为入射光的强度以通过参比池的光强度作为入射光的强度。这样使待测物质。这样使待测物质的浓度与吸光度值之间的关系符合朗伯的浓度与吸光度值之间的关系符合朗伯- -比耳定律。比耳定律。（1）MR有色，有色，R、N、NR均无色，均无色，纯溶剂纯溶剂（蒸馏水）作参（蒸馏水）作参比溶液。比溶液。（2） MR、R有色，有色，N、NR无色，可选择不含待测组分的无色，可选择不含待测组分的试试剂空白剂空白作参比溶液。作参比溶液。（3） MR、 N 有色，有色， R 、NR无色，用不加显色剂的被测试无色，用不加显色剂的被

17、测试液作参比溶液。（液作参比溶液。（试液空白试液空白）假设试样中含有假设试样中含有M 、N（共存离子）（共存离子）试液试液MN+ R+ 水（参比）水（参比）试液试液MN（4 4） MR、R 、N 、NR均有色，均有色，可在试液中加入适当掩蔽可在试液中加入适当掩蔽剂将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，然后加剂将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，然后加 入显色剂及其他试剂，以此作为参比溶液。（入显色剂及其他试剂，以此作为参比溶液。（褪色空白褪色空白）MRNR+ R试液试液MN（参比）（参比）MS（无色）（无色）NR+ S + R 试液试液MNS的作用是掩蔽褪色的作用是掩蔽褪色 三、三、

18、吸光度读数范围的选择吸光度读数范围的选择控制控制吸光度吸光度A：0.151.0通过改变通过改变吸收池厚度吸收池厚度或或待测液浓度待测液浓度，使，使A处在适宜范围。处在适宜范围。 四、四、标准曲线的绘制标准曲线的绘制由由 A=abc 或或 A=bc 可知：可知：吸光度吸光度A与物质的浓度成正比，以与物质的浓度成正比，以A对对c作图，应得一直线，作图，应得一直线，该直线称为工作曲线该直线称为工作曲线.( Standard curve）在相同条件下测的试液的吸光度，在相同条件下测的试液的吸光度，从工作曲线上就可查到试液的浓从工作曲线上就可查到试液的浓度度, 该方法称为该方法称为工作曲线法工作曲线法。

19、注意什么？注意什么？a. 标准溶液浓度必须在线性范围内，标准溶液浓度必须在线性范围内，即符合即符合A= bc b. 试液的吸光度必须在标准曲线范围内，即试液的吸光度必须在标准曲线范围内，即A1 Ax An原因？原因？将会引起较大的误差。将会引起较大的误差。AC正偏离正偏离负偏离负偏离标准曲线标准曲线 对朗伯比尔定律的偏离对朗伯比尔定律的偏离五、五、光度分析法的误差（准确度）光度分析法的误差（准确度） 在实际分析中，常会发现标准曲线发生弯曲，尤其当溶液在实际分析中，常会发现标准曲线发生弯曲，尤其当溶液浓度较高时。这种现象称为对朗伯浓度较高时。这种现象称为对朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。对定

20、量分析有何影响？对定量分析有何影响？非单色光引起的偏离；非单色光引起的偏离；物理、化学因素：非均匀介质及化学反应；物理、化学因素：非均匀介质及化学反应；吸光度测量的误差。吸光度测量的误差。 a. 非单色光引起的偏离非单色光引起的偏离 *朗伯朗伯-比尔定律只适用于单色光比尔定律只适用于单色光。但由于单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，但由于单色器色散能力的限制和出口狭缝需要保持一定的宽度，所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波所以目前各种分光光度计得到的入射光实际上都是具有某一波段的复合光。段的复合光。由于物质对不同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯由于物质对不

21、同波长光的吸收程度的不同，因而导致对朗伯比尔定律的偏离比尔定律的偏离。复合光由复合光由1 1和和2 2组成，对于浓组成，对于浓度不同的溶液度不同的溶液a a和和b,b,引起的吸光引起的吸光度的偏差不一样，浓度大，复度的偏差不一样，浓度大，复合光引起的误差大，故在高浓合光引起的误差大，故在高浓度时线性关系向下弯曲。度时线性关系向下弯曲。 * 克服非单色光引起的偏离的措施克服非单色光引起的偏离的措施 使用使用比较好的单色器比较好的单色器，从而获得纯度较高的，从而获得纯度较高的 “单色光单色光”，使，使标准曲线有较宽的线性范围。标准曲线有较宽的线性范围。 人射光波长选择人射光波长选择 maxmax

22、，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸，保证测定有较高的灵敏度，此处的吸收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的收曲线较为平坦，在此最大吸收波长附近各波长的光的值大值大体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。体相等，由于非单色光引起的偏离要比在其他波长处小得多。b. 物理化学因素引起的偏离物理化学因素引起的偏离例：例：Cr2O72- + H2O 2H+2CrO42- （橙色橙色） （黄色）（黄色） u非均匀介质非均匀介质 胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增胶体，悬浮、乳浊等对光产生散射，使实测吸光度增加，导致标准曲线性向上弯曲。加，导致标准曲线性向上弯曲。u 化学

23、反应化学反应若溶液中存在着离解、缔合、互变异构、配合物的形若溶液中存在着离解、缔合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时，将使吸光质点的浓度发生变化。成等化学平衡时，将使吸光质点的浓度发生变化。如果控制溶液均在如果控制溶液均在高酸度高酸度时测定，由于六价铬均以时测定，由于六价铬均以Cr2O72形式形式存在，就不会引起偏离。存在，就不会引起偏离。吸光度标尺刻度不均匀吸光度标尺刻度不均匀c. 吸光度测量的误差引起的偏离吸光度测量的误差引起的偏离不同的透射率读数，产生的误差大小不同：不同的透射率读数，产生的误差大小不同： lgT= b c微分：微分：dlgT0.434dlnT = - 0.434T-1 dT