二英对大鼠成骨细胞增殖及分泌功能影响

1、         【摘要】     目的 探讨二?英(TCDD)对大鼠成骨细胞增殖及分泌功能的调控作用。方法 应用1×10-101×10-8mol/L浓度的二?英作用原代培养的大鼠颅盖骨成骨细胞24 h；采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)法检测二?英对成骨细胞增殖能力的影响；采用对硝基酚磷酸盐法测定成骨细胞培养液碱性磷酸酶(ALP)浓度。结果 二?英对大鼠成骨细胞增殖和分泌功能有负性调节作用，与对照组比较，1×10-8mol/L的二?英使大

2、鼠成骨细胞增殖能力降低60，使成骨细胞ALP活性减少58，差异有统计学意义(P    【关键词】  二?英；成骨细胞；细胞增殖    二?英(TCDD)是人类生存环境中广泛存在的类雌激素样环境污染物质，TCDD类不是人们有意生产的化学品，而是在废弃物焚烧、化工生产、金属冶炼等随废气或残渣排放的微量或痕量污染物。关注TCDD类对人体健康的影响，也促进了TCDD类毒理学研究。TCDD具有分布广泛、生物半衰期长、生物体内蓄积、致畸致癌等生物特征，但其对机体的毒性作用机制还不完全清楚1。成骨细胞主要完成成骨活动，

3、一般认为碱性磷酸酶(ALP)是成骨细胞分泌的早期标志，骨钙素是成骨细胞分化成熟的标志，I型胶原也是成骨细胞的标志物之一。本文研究TCDD对大鼠成骨细胞增殖及分泌功能的作用机制，为TCDD在骨骼发育成骨细胞功能转变方面研究提供理论依据。    1  材料与方法    1?1  材料  Wistar大鼠(中国医科大学动物部)；TCDD、M-MLV逆转录试剂盒和PCR试剂(美国Promega公司)；Trizol RNA抽提试剂和胎牛血清培养基(DMEM)(美国Gibco公司)。新生牛血清(杭

4、州四季青生物制品公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶，2型胶原酶，二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；碱性磷酸酶试剂盒(北京中生北控生物科技股份有限公司)。    1?2  成骨细胞的体外培养  取出生24 h内的Wistar大鼠，采用颅盖骨消化法培养成骨细胞。待细胞长满培养瓶壁时传代培养，传至第2代时用差速贴壁法除去成纤维细胞。    1?3  TCDD作用成骨细胞  成骨细胞常规培养于10的DMEM培养基(含有10胎牛血清、100 U/ml青霉素、100

5、 g/ml链霉素)，在37、5CO2培养箱中贴壁生长。培养24 h达对数生长期进行实验。实验分组：第1组第4组TCDD浓度分别为0，1×10-10，1×10-9，1×10-8 mol/L。TCDD均溶于DMSO，浓度为1×10-4 mol/L。第1组为对照组，加入等体积的DMSO，DMSO终体积不超过0?1，此浓度的DMSO对细胞生长无明显影响。培养24 h后收集细胞。    1?4  MTT法检测成骨细胞增殖  第2代成骨细胞以1×105/ml的密度分别植入3块96孔板中，每板接种3

6、6孔，每孔100 l，用含10胎牛血清的DMEM培养24 h后换无血清DMEM再培养24 h(此为清洗期)；设立对照组，仍使用无血清DMEM培养，试验组分别用含不同浓度TCDD的无血清DMEM培养，每组6孔，在设定的培养(24 h)结束前4 h每孔加入MTT(5 mg/ml)20 l，继续培养4 h，吸弃孔内培养液，加入DMSO 150 l，振荡10 min,使结晶物充分溶解，490 nm波长测定吸光度(A)值。    1?5  成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)活性检测  第2代成骨细胞以3×104/ml的密度接种到2块6孔板中

7、，每孔3 ml用含10%灭活胎牛血清(FBS)的DMEM培养14 d(每3 d换液)，更换无血清培养基24 h后，设立的对照组(n=6)仍使用无血清DMEM培养，试验组的培养液为含TCDD的无血清DMEM，培养48 h后，吸弃孔中的培养液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗2遍，每孔加入细胞裂解液1 ml(细胞裂解液配方：10 mmol/L pH=7?5的Tri.HCl加入体积比为0?1 Triton X-100)，37作用20 min，收集裂解液采用对硝基酚磷酸盐法测定ALP浓度，采用Braford法测定裂解液中总蛋白浓度，ALP活性以U/mg蛋白表示。    

8、;1?6  统计分析  采用SPSS 12统计软件进行方差分析(ANOVA)。    2  结果    2?1  TCDD对成骨细胞增殖能力的影响(表1)  TCDD作用时间24 h，TCDD浓度在1×10-101×10-8mol/L之间，随着TCDD浓度的递增，原代培养的成骨细胞中MTT产物的A值呈下降趋势，其中1×10-8mol/L的TCDD使成骨细胞增殖能力增加60%，差异有统计学意义(P<0.05)。  

9、;  表1  TCDD对成骨细胞增殖及分泌功能的影响（略）    注：与对照组比较，* P<0?05    2?2  TCDD对成骨细胞ALP活性的促进作用  采用对硝基酚磷酸盐法测定成骨细胞培养液中ALP的浓度，随着TCDD浓度的递增，原代培养的成骨细胞中ALP活性明显降低，其中1×10-8mol/L的TCDD使成骨细胞ALP活性降低58，差异有统计学意义(P<0?05)。    3  讨论&

10、#160;   随着工业的发展环境污染日趋严重，TCDD对人类健康产生了严重的危害，导致肿瘤、免疫缺陷、神经毒效应等，尤其是类似雌激素作用的环境内分泌干扰物引起动物生殖变异，出生缺陷和骨质疏松。但是，对骨骼发育及代谢的影响机制尚未完全阐明。Ivnitsk等2同用鸡胚模型观察到TCDD可以影响鸡胚心肌细胞的增殖与凋亡，继而影响心血管系统结构的正常发育，最终导致畸形的发生。成骨细胞的增殖及分泌功能被认为是骨骼发育、生长、重塑过程的关键环节3。成骨细胞的发育、成熟、活化受多种因素调控，其中雌激素能通过某些特定的细胞因子对成骨细胞的功能发挥调节作用。本研究发现，TCDD明

11、显抑制成骨细胞增殖能力。细胞的功能是指细胞在分化的基础上完成特定功能活动，如分泌、传导、吞噬等。成骨细胞具有分泌功能，一般认为ALP是成骨细胞分泌的早期标志4。本研究发现，在大鼠颅盖骨培养的成骨细胞中，1×10-8mol/L的TCDD明显抑制成骨细胞增殖，并且显著降低成骨细胞基质中的ALP含量。TCDD对成骨细胞增殖、分化的差别可能与各细胞系的种属差异、细胞异质性、分化阶段不一、TCDD受体含量低或受体变异等有关。    【参考文献】  1 Yumei Guo，Andrew G，Hendrickx，et al.Endocrine bi

12、omarkers of early fetal loss in cynomolgus macaques(Macaca fascicula ris) following exposure to dioxinJ.Biology of Reproduction，1999，60(4)：707-713.        2 Ivnitski I，Elmaoued R，Walker MK.2,3，7，8?tetrachlorodibonzo?p?dioxin(TCDD) inhibition of coronary develo

13、pment is preceded by a decrease in myoeyte proliferation and an increase in cardiac apoptosisJ.Teratology,2001，64(4)：201-212.        3 Cointry GR，Capozza RF,Negri AL,et al.Biomeohanieal background for a noninvasive assessment of bone strength and muscle?bone interactionsJ.J Museuloskelet Neuronal Interact,2004，4(1)：1-11.        4 Coelho MJ，Femandes MH.Human bone cell calmros