SARS病毒形态学

1、本文由【中文word文档库】 搜集整理。中文word文档库免费提供海量教学资料、行业资料、范文模板、应用文书、考试学习和社会经济等word文档SARS病毒形态学 我国第一例SARS死亡患者的病理尸体解剖是丁彦青等1，2 于2月11日在广州南方医院病理科进行的，很快2月13日尸检病理诊断报告为病毒性肺炎。现在看来这个病理诊断是及时正确的。问题是什么病毒会引起如此严重的致死性肺炎，是已知病毒，还是一种新病毒，这就需要应用电镜根据病毒的形态学和形态发生学超微结构特征来加以分析和判断。在应用电镜诊断SARS病原的过程中，早在2003年2月26日军事医学科学院微生物流行病研究所已在SARS尸检

2、组织细胞培养物中通过负染电镜发现了很典型的冠状病毒粒子，但因为种种原因，未能及时向外界公布，错失良机3。4月8日香港大学Queen Mary医院微生物和病理系报道成功地检出SARS相关冠状病毒4，4月10日世界卫生组织（WHO）确认一种新的冠状病毒与SARS相关5，而中国北京疾病预防控制中心（CDC）病毒病预防控制所有关专家的衣原体之说从2月18日开始一直是媒体报道的热点。4月16日中国科学院基因组研究所从军事医学科学院微生物流行病研究所送检的4个不同的SARS病毒培养分离物中读出全病毒基因序列，进一步证实冠状病毒是一种新的传染性因子6。第一节 SARS病毒电镜形态学诊断的正确方法一、SARS

3、患者生前肺活检组织（细针穿刺）和支气管肺泡冲液是电镜快速检出冠状病毒的首选样品香港大学Queen Mary医院微生物和病理系的Peiris等4是最早报道应用负染和超薄切片电镜技术从SARS患者生前肺活检组织以及鼻咽部吸出物的病毒分离培养物中发现冠状病毒的。继而，Ksiazek等5从第一例医院内感染的男性医生的鼻咽部和咽拭子样品的病毒分离培养物中也检出SARS相关冠状病毒。他们还在一例SARS患者的支气管肺泡冲洗液中检出感染冠状病毒的脱落上皮细胞，在细胞内和细胞外均查见许多病毒粒子。经验证明，直接从病理尸检脏器组织的超薄切片中检出病毒，并诊断、鉴定病毒到科几乎是不可能的。原因很简单，在电镜生物样

4、品制备中，标本的固定非常关键，组织一旦离开血液供应，必须立即用固定液固定，间隔时间越短越好。有人观察，如果延误15-30秒固定，线粒体内致密颗粒就会减少或消失；延误15-30分钟，线粒体肿胀，内质网扩张呈小泡状，核染色质边集；延误45分钟后，线粒体内出现絮状沉淀物7。如果时间再长便会产生细胞自溶，不仅正常细胞的微细结构不可避免的产生损伤和破坏，在活细胞内寄生、增殖的各种病原微生物（包括病毒、立克次体和衣原体等）也会同时失去原有的形态特征，因而难以作出正确的判断和鉴定，甚至会造成误诊8。二、分离病毒阳性的培养细胞是电镜诊断、鉴定病毒的最佳样品作为病理工作者可以应用电镜从活检组织、支气管肺泡冲洗液

5、或其他体液的脱落活细胞中检出病毒，但临床采集样品的难度较大，还可能因采集不够及时，出现组织细胞自溶，细胞超微结构和病毒的形态学特征难以保存完好。另外，患者脏器组织中病毒感染病灶往往很局限，而电镜取材又要求大小不超过1 mm3，以确保细胞固定良好，因而很难在病变细胞的超薄切块中找到病毒。所以对怀疑病毒感染的组织或体液（含血液）多数需要在病毒实验室经过体外接种敏感细胞（原代或传代细胞），待病毒增殖后出现细胞病变（CPE）方有可能检出病毒；也可以通过接种敏感实验动物获得阳性病毒样品。Peiris等4最先在电镜下发现的冠状病毒就是从分离培养病毒的胚胎猴肾细胞的提取液经超速离心纯化后，在负染电镜样品中检

6、出的。军事医学科学院微生物流行病研究所在负染电镜下最早发现的冠状病毒也是从SARS死亡患者尸检肺组织通过在绿猴肾细胞（Vero-E6）上分离培养获得的3，后经超薄切片证实其形态学和形态发生学超微结构特征符合冠状病毒科（Coronaviridae）的成员9。 第二节 冠状病毒的分类、命名及其形态结构特征一、冠状病毒的分类与命名10冠状病毒科（Coronaviridae）成员均为单链RNA病毒，在分类学上和动脉炎病毒科（Arteriviridae）同属于巢病毒目（Nidovirales）。该科病毒又分两个属（Genus）：冠状病毒属（Coronavirus）和环状病属（Torovirus

7、）。冠状病毒的命名学结构如下：冠状病毒的命名学结构（Taxonomic Structuce of Coronavirus）目（Order）巢病毒目（Nidovirales）科（Family）冠状病毒科（Coronaviridae）属（Genus）冠状病毒属（Coronavirus）冠状病毒属内的各种病毒（Species in the Genu）第一组病毒（Group 1 Species）犬冠状病毒（Canine coronavirus , CCoV）猫冠状病毒（Feline coronavirus, FCoV）猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitis vi

8、rus, FIPV）人冠状病毒229E（Human coronavirus 229E, HcoV-229E）猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）传播性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus, TGEV）猪呼吸道冠状病毒（Porcine respiratory coronavirus, PRCoV）第二组病毒（Group 2 Species）牛冠状病毒（Bovine coronavirus, BCoV）人冠状病毒OC43（Human coronavirus OC43, HcoV-OC43）鼠肝炎

9、病毒（Murine hepatitis virus, MHV）猪凝血性脑脊髓炎病毒（Porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus, HEV）大鼠冠状病毒（Rat coronavirus, RtCoV）涎管泪腺炎病毒（Sialodacryoadenitis virus, SDAV）第三组病毒（Group 3 Species）传染性气管炎病毒（Infectious bronchitis virus, IBV）火鸡冠状病毒（Turkey coronavirus, TCoV）冠状病毒属内的暂定病毒(Tentative Species in the G

10、enus)兔冠状病毒（Rabbit coronavirus, RbCoV）二、冠状病毒科病毒的电镜形态结构特征冠状病毒科（Coronaviridae）所属成员具有独特的形态学和形态发生学特征。病毒粒子呈球形或多形态，有包膜（envolope），直径在80-160 nm。核衣壳螺旋对称，其直径在9-13 nm。成熟病毒粒子的包膜上有大而宽距的梅花瓣状纤突（spike），长约20 nm，呈皇冠状分布，因而得名。冠状病毒有5种相关的结构蛋白，其中纤突糖蛋白（spike glycoprontein, S）最大，还有膜蛋白（membran protein,M）、核衣壳蛋白（nueleocapsid pr

11、otein，N）、小分子外膜蛋白（small-envelope protein,E）和血凝素酯酶蛋白（hemagglutinin-esterase protein, HE）。（图1）。病毒通过内吞进入靶细胞。病毒在细胞中复制、组装，在粗面内质网内膜上芽生成熟。在感染细胞扩张的核周隙和粗面内质网池中常有数目不等的成熟病毒粒子。经胞吐释放到细胞外的大量病毒粒子常聚集在细胞突起之间或附着在细胞质膜表面11-14。三、SARS相关冠状病毒的形态特征2003年4月16日WHO宣布，经过全球科研人员的通力合作，正式确认SARS的病原体是一种新型的冠状病毒，并将该病毒命名为SARS冠状病毒（SARS-cor

12、onavirus, SARS-Cov）。SARS-CoV与我们在1972年昆明地区从普通感冒者咽喉含漱液中分离病毒培养物中发现的冠状病毒的形态基本一致11。在高倍负染电镜图像中，可以清晰地分辨出SARS-CoV病毒粒子包膜表面的冠状纤突（图2）。在超薄切片电镜下，感染细胞（Vero-E6）病变较明显，胞质内含病毒粒子的大小不等，囊泡较多，囊泡腔内的成熟病毒粒子数目不等，在一个泡剖面中少则3-5个，也可以高达150个或更多（图3A-3D）。病毒形状多数呈圆形，少数呈长园形或梨形，直径在60-180 nm。在高倍电镜图像中可分辨出成熟病毒粒子的双层脂质外膜和非立体对称的核衣壳丝（图3C）。偶见病毒

13、在内质网膜上芽生成熟。病毒粒子通过胞吐释放至细胞外（图3D）。上述感染细胞内病毒的形态学和形态发生学特征符合冠状病毒科成员的形态学指征，确定它是SARS的可能病原体是可靠的。再进一步通过病毒结构蛋白质的免疫原性鉴定、基因组测序和结构研究以及感染实验动物（食蟹猴）分离、培养病毒阳性，最后确定SARS的病原体是一种新型冠状病毒。第三节 SARS相伴呼肠病毒一、SARS相伴呼肠病毒的检出及其电镜形态学特征2003年3月13日301医院呼吸科送军事医学科学院微生物流行病研究所的北京第一例SARS患者于某及其母的咽拭子样品要求分离军团菌和衣原体，结果均为阴性。再将咽拭子标本接种Hep-2和Vero-E6

14、细胞分离病毒，取细胞培养上清提取病毒RNA进行RT-PCR检测未扩增出SARS-CoV特异性DNA片段。后来，却在分离病毒阳性的培养细胞的超薄切片中在电镜下意外地发现了呼肠病毒（reovirus）15。继而，又从6月9日北京佑安医院SARS死亡患者尸检肺组织分离病毒的培养细胞中再次检出呼肠病毒16。在透射电镜下，感染呼肠病毒的细胞核周胞质内可查见大小不等、无定形的病毒包涵体。包涵体由中等致密的细丝状病毒浆（viral plasm）和数目不等的空心和实心病毒粒子以及少量微管样结构所组成。组装不完善的病毒粒子仅有一个厚约14 nm的外壳（衣壳），核心空亮为不成熟病毒粒子，排列无序。组装完善的病毒粒

15、子核心致密为成熟病毒粒子，核衣壳立体对称、裸露、无包膜、呈球形或类六边形、直径在60-80 nm，致密核心直径约52 nm，常排列呈典型的晶格状。在病毒包涵体内还可以查见少量平行排列、壁较厚的微管样结构，直径略小于病毒衣壳，它有可能是病毒衣壳蛋白的前体结构。在细胞病变特别严重的感染细胞内，病毒粒子排列松散、间距增宽，在包涵体外周可查见散在的病毒粒子分布在变性肿胀的线粒体和粗面内质网以及细胞碎片和游离的微绒毛之间（图4A-4D）。由此可以推测，病毒粒子通过细胞裂解后释放。根据上述感染细胞内病毒形态学和形态发生学特征可以鉴定所检出的病毒为呼肠病毒科（Reoviridae）成员，并进一步针对呼肠病毒

16、的基因保守序列（S2基因片段）设计引物，经RT-PCR扩增出特异的DNA片段，DNA序列分析表明是一种独特的呼肠病毒，归类为呼肠病毒科正呼肠病毒属（Orthoreovirus）15。二、正呼肠病毒属的命名学结构（Taxonomic Structuce of The Orthoreovirus）10科（Family）呼肠病毒科（Reoviridae）属（Genus）对人类致病的病毒属：正呼肠病毒属(Orthoreovirus)眶病毒属(Orbireovirus)轮状病毒属(Rotavirus)科罗拉多蜱传热病毒属(Coltivirus)正呼肠病毒属内的病毒种（Species in the Ort

17、horeovirus）亚组1（Subgroup 1） 哺乳动物正呼肠病毒（Mammalian orthoreovirus, MRV）血清型1 serotype 1 (strain Lang), MRV-1血清型2 serotype 2 (strain D5/ Jones), MRV-2血清型3 serotype 3 (strain Dearing), MRV-3亚组2（Subgroup 2） 鸟正呼肠病毒（Avian orthoreovirus, ARV） 纳尔逊海湾正呼肠病毒（Nelson Bay orthoreovirus, NBV）亚组3（Subgroup 3） 狒狒正呼肠病毒（Babo

18、on orthoreovirus, BRV）正呼肠病毒属内待选定的各种病毒（Tentaive Species in the Genus）蟒蛇属正呼肠病毒（Python orthoreovirus,PRV）响尾蛇属正呼肠病毒（Rattlesnake orthoreovirus,RRV）Ndelle病毒（啮齿动物）(Ndelle virus rodents, NDEV)三、呼肠病毒的致病性应用透射电镜，在分离呼肠病毒阳性的体外培养细胞中还发现不少具有典型超微结构病变特征的凋亡细胞。个别凋亡早期的感染细胞的细胞核形状不规则，核染色质浓缩、边集，胞质内尚可查见呼肠病毒包涵体的残迹，其中病毒粒子已失去病

19、毒衣壳，但仍排列呈晶格样（图5）。早期凋亡细胞胞核形状变化不大，核染色质呈不规则浓缩、边集或呈平台状，细胞外常可查见凋亡小体。到后期，凋亡细胞高度皱缩，核固缩，并碎裂成大小不等的核碎片，胞质稀少，胞体呈芽球状，细胞外出现一些形状多样的含核质凋亡小体17。有研究表明，呼肠病毒可诱导体外培养细胞的凋亡，而且不同病毒株之间有差异，并认为成熟病毒粒子与宿生细胞表面受体的相互作用是导致细胞凋亡是病毒杀死细胞的重要机制18，19。从SARS患者生前咽拭子和尸检肺组织中先后分离、检出呼肠病毒，而且患者血清中呼肠病毒的中和抗体滴度可达1：28至1：40。实验动物（食蟹猴）接种病毒后出现发热症状，持续4天，最高

20、体温可达40.4。从感染动物的肺、心、肝、脾及粪便中均分离到呼肠病毒，并呈现间质性肺炎、脾脏和淋巴结萎缩以及全身小静脉淤血等一列系组织病理改变20，21。另据文献报道，呼肠病毒可导致人和实验动物的致死性间质性肺炎、肺组织纤维化和急性呼吸窘按迫期综合症（acute respiratory distress syndrome,ARDS）或细支气管炎闭塞性机化肺炎（bronchiolitis obliterans organizing pneumonia,BOOP），而该病毒所致肺炎最明显的和最重要的病理改变是肺泡炎和肺纤维化22-25。在SARS流行期间我们先后从SARS患者生前咽拭子和尸检肺组织

21、中分离、检出呼肠病毒为SARS的病原体和发病机制的研究提出了新的问题。四、呼肠病毒与冠状病毒的叠加感染早在1972年我们曾在一份分离普通感冒病毒阳性的人胚肾培养细胞的超薄切片中，在电镜下不仅在国内首次发现了冠状病毒，而且查见冠状病毒与微小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的鼻病毒（rhinovirus）同时出现在一个细胞培养物中，甚至是同在一个感染细胞内11。当时认为有可能是所谓的病毒激敏现象。这次，在SARS患者于某之父尸检肺组织分离病毒阳性Vero-E6细胞的超薄切片中又发现冠状病毒与呼肠病毒的叠加感染（superinfection）8，15。在同一个感染细胞核旁胞质内同时见到

22、扩大的粗面内质网囊泡中有许多冠状病毒粒子，而核另一侧有排列呈晶格状的呼肠病毒的包涵体（图6A-6C）。这就联想到会不会由于冠状病毒叠加感染的病毒不同而使其致病性产生很大差异，前者引起普通感冒；而后者引起凶险的SARS。这个问题值得病毒学工作者关注和进行深入研究。这次冠状病毒所引起的SARS与以往冠状病毒科所属病毒所致人类传染病有所不同，病情凶险、传染性强、传播快、扩散面广、死亡率高，在短期内发生如此大规模的流行是近年来世界上所未见过的。幸好，在SARS暴发流行初期，我国科研工作者联合有关国家和地区的研究机构，通过有关实验室的共同努力，在很短时间里就分离出SARS相关冠状病毒。在寻找SARS病原

23、体的过程中，无论是患者先前肺活检组织（细针穿刺）和支气管肺泡冲洗液；还是用传统的病毒分离培养技术，从采集不同的标本（血液、血清、鼻咽拭子、含嗽液和患者尸检组织）接种不同细胞系，分离病毒，并在出现细胞病变（CPE）后的培养物，均在应用常规的电镜技术（负染和超薄切片）后就发现了典型的冠状病毒。随后的血清学检测以及病毒的基因组和结构蛋白的研究证明了导致世界不同地区SARS流行的为同一病原。而从SARS患者生前咽拭子和尸检肺组织的病毒分离培养物中先后应用电镜发现呼肠病毒和两种病毒（冠状病毒与呼肠病毒）的叠加感染充分说明，传统的病毒形态学和形态发生学的电镜研究在发现新病毒和两种病毒以上的叠加感染具有不可

24、取代的重要作用。参 考 文 献 1丁彦青，王慧君，申洪等，严重急性呼吸综合征病原体检测及临床病理学观察：中华病理学杂志J2003，32：195-2002Ding YQ, Wang HJ, Shen H. et al. The clinical pathology of severe acute respiratory syndrome(SARS): a report from China. J Pathol J2003;200:282-2893Enserink M. Chinas missed chance. Science J 2003,301:294-2964Peiris J S

25、 M, Lai S T,Poon L L M, et al. Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndromeJ. Lancet ,2003,361: 1319-13255Ksiazek TG, Erdman D, Goldsmith C S, et al. A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndromeJ. N Engl J Med, 2003, 348: 1953-19666秦鄂德，祝庆余，于曼，等。SARS相关

26、病毒（BJ01株）的全序列及其比较分析J.科学通报，2003，48：1127-11347沙继宏，夏愿耀，于秉学，郑尊. 超微病理诊断标本制备方法，见：武忠弼，主编，超微病理诊断学M.上海：上海科学技术出版社，2003.26-558陈德蕙.从SARS病原体电镜诊断得到启示J.电子显微学报，2004，23：1-8.9 祝庆余，秦鄂德，王翠娥，等。非典型肺炎病例标本中新型冠状病毒的分离与鉴定J.中国生物工程学报，2003，23：106-112。10Van Regenmortel MHV, Fauquer CM, Bishop DHL, et al. 2000,Virus Taxonomy, Seve

27、nth Report of the International Committee of VirusesJ. New York. San Diego: Academic Press11陈德蕙.几种呼吸道病毒的电子显微镜鉴定J.中华医学杂志，1974，54：211-215。12陈德蕙。传染病病理（二），病毒、衣原体和立克次氏体疾病.白希清主编。 病理学M，第二版。北京：科学出版社，1987。419-45813陈德蕙，张贺秋，王国华.电镜在病毒感染诊断中的应用J.电子显微镜学报,1997，16:549-568. 14陈德蕙，张贺秋。病毒、立克次体、衣原体和支原体感染的电镜诊断。见：武忠弼，主编，超

28、微病理诊断学M.上海：上海科学技术出版社，2003.663-737.15端青，朱虹，杨怡，等。呼肠病毒，在SARS患者中分离与初步鉴定J。科学通报，2003，48：1369-1372。16杨怡，李卫华，端青，朱虹，等。再次从SARS患者肺组织中分离与检出呼肠病毒（简报）J.军事医学科学院院刊，2003，27（4）封二17杨怡，陈德蕙，端青，等.呼吸病毒与细胞凋亡J.电子显微学报，2004，23：195-19918 Duncan MR, Stanish SM, Cox DC. Differential sensitivity of normal and transformed human cells to reovirus infectionJ.J Virol,1978,28:444-449.19 Tyler K, Squier MKT, Rodgers SE, et al. Differences in