第九章吸光光度法

1、1第九章 吸光光度法2 基于物质对光的基于物质对光的选择性吸收选择性吸收而建立起来的分析方法称为而建立起来的分析方法称为吸光光度法吸光光度法, ,包括包括: :比色法，可见、紫外、红外分光光度法。比色法，可见、紫外、红外分光光度法。红外吸收光谱：红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围分子振动光谱，吸收光波长范围2.52.5 1000 1000 m , m , 主要用于有机化合物结构鉴定。主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱：紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围200200 400 400 nmnm，可用于结构鉴定和定量分析。，可用于结构鉴定和定量分析。

2、可见吸收光谱：可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围电子跃迁光谱，吸收光波长范围400400 750 750 nm nm ，主要用于，主要用于有色物质有色物质的定量分析。的定量分析。 本章主要讲授本章主要讲授 可见分光光度法。可见分光光度法。38-1 吸光光度法基本原理比色法介绍比色法介绍4一、物质对光的选择性吸收1光的基本性质光的基本性质 光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长长 、频率、频率 、光速、光速c、波数（、波数（cm-1）等参数来描述：）等参数来描述： = c ； 波数波数 = 1/ = /c 光是由光子流组成，光子

3、的能量：光是由光子流组成，光子的能量： E = h = h c / （Planck常数常数：h=6.626 10 -34 J .S )光的波长越短（频率越高），其能量越大。光的波长越短（频率越高），其能量越大。白光白光(太阳光太阳光)：由各种单色光组成的复合光：由各种单色光组成的复合光,是连续光谱。是连续光谱。单色光：单波长的光单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成由具有相同能量的光子组成)可见光区：可见光区：400-750 nm紫外光区：近紫外区紫外光区：近紫外区200 - 400 nm 远紫外区远紫外区10 - 200 nm （真空紫外区）（真空紫外区） 52. 物质对光的选择性吸收

4、物质对光的选择性吸收 当一束白光通过一有色溶液时，当一束白光通过一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过。透射光的波长决定了长的光则透过。透射光的波长决定了溶液的颜色。透射光波与吸收光波成溶液的颜色。透射光波与吸收光波成互补关系。能够组成白光的两种光称互补关系。能够组成白光的两种光称为补色光，两种颜色互为补色。为补色光，两种颜色互为补色。物质颜色吸收光颜色波长/nm黄绿黄橙红紫红紫蓝绿蓝蓝绿紫蓝绿蓝蓝绿绿黄绿黄橙红400-450450-480480-490490-500500-560560-600600-650650-780红红橙橙黄黄绿绿青青

5、青蓝青蓝蓝蓝紫紫 63. 物质吸收光的本质物质吸收光的本质M + h M *基态基态 激发态激发态E1 （E） E2M + 热M + 荧光或磷光 E = E2 - E1 = h 量子化量子化 ；选择性吸收；选择性吸收; 分子结构的复杂性使其对不分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；同波长光的吸收程度不同； 用不同波长的单色光照射，测用不同波长的单色光照射，测吸光度吸光度 吸收曲线与最大吸收波吸收曲线与最大吸收波长长 max；74. 吸收曲线吸收曲线 同一种物质对不同波长同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为大处对应的波长称为最大吸最大吸

6、收波长收波长maxmax 不同浓度的同一种物质，不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似其吸收曲线形状相似maxmax不变。而对于不同物不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和质，它们的吸收曲线形状和max则不同。则不同。 吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。分析的依据之一。 不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度 A 有有差异，在差异，在max处吸光度处吸光度A 的差异最大。此特性可作为物质定的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。量分析的依据。 在在max处吸光度随浓

7、度变化的幅度最大，所以测定最处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据8二、光吸收的基本定律朗伯比耳( (Lamber-Beer)定律1. 朗伯朗伯比耳定律比耳定律描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系描述物质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度的关系定律：定律：BeerLamberrtAIIII0 吸收吸收 透射透射 反射反射测定时用空白作参比测定时用空白作参比, Ir影响抵消影响抵消tAIII0令令:ttIITAIIT00log1log/A = k1 bA = k2 CT透光率

8、透光率，数值，数值从从0到到1，等间隔，等间隔标尺；标尺；A吸光度吸光度，数值，数值从从到到0，对数，对数标尺。标尺。92.2.朗伯朗伯比耳定律数学表达式比耳定律数学表达式A= log(I0/It) = bc式中式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；：吸光度；描述溶液对光的吸收程度； b：液层厚度：液层厚度(光程长度光程长度)，通常以，通常以cm为单位；为单位； c：溶液的摩尔浓度，单位：溶液的摩尔浓度，单位molL； ：摩尔吸光系数，单位：摩尔吸光系数，单位Lmolcm；等于浓度为等于浓度为1mol/L、液层厚度为、液层厚度为1cm时，溶液在某一波长下的吸光度。时，溶液在某一波长下的吸光度

9、。 或或: Alg（I0/It)= a b c c：溶液的浓度，单位：溶液的浓度，单位gL a：吸光系数，单位：吸光系数，单位Lgcm；相当于浓度为相当于浓度为1 g/L、液层厚度为、液层厚度为1cm时，溶液在某一波长下的吸光度。时，溶液在某一波长下的吸光度。 a与与的关系为：的关系为： a =/M （M为摩尔质量）为摩尔质量） 10例：铁（例：铁（II）质量浓度为）质量浓度为5.0104g/L的溶液，与邻二杂的溶液，与邻二杂氮菲反应生成橙红色配合物，该配合物在波长氮菲反应生成橙红色配合物，该配合物在波长508 nm，比色皿厚度为比色皿厚度为2cm时，测得时，测得A=0.19，计算邻二杂氮菲亚

10、铁，计算邻二杂氮菲亚铁的的a及及。解：解：Fe的原子质量为的原子质量为55.8cmgLbCAa./190100 . 5219. 04cmmolLMa./1006. 18 .551904(0.19L/mg.cm)113. 摩尔吸光系数的讨论摩尔吸光系数的讨论 吸收物质在一定条件下的特征常数；吸收物质在一定条件下的特征常数； 的大小与吸光物质的性质的大小与吸光物质的性质(待测物，显色剂，溶剂等待测物，显色剂，溶剂等)和和测量条件测量条件(温度，波长温度，波长)有关。有关。 与浓度与浓度c和光程长度和光程长度b无关。无关。 同一吸收物质在不同同一吸收物质在不同下的下的值是不同的。在最大吸收波值是不同

11、的。在最大吸收波长长max处的摩尔吸光系数，常以处的摩尔吸光系数，常以max表示。表示。max表明了该吸收表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的达到的最大灵敏度。最大灵敏度。max越大，表明物质的吸光能力越强，用光度法测定该物越大，表明物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。质的灵敏度越高。105：超高灵敏；：超高灵敏；104 ：不灵敏。：不灵敏。bcA12 在数值上等于浓度为在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为、液层厚度为1cm时该溶液时该溶液在某一波长下的吸光度。在某一波长下的吸光度。例：

12、根据朗伯例：根据朗伯-比耳定律，把以下测定比耳定律，把以下测定Cu(63.55)空白项填上空白项填上bcAMa/%3 .11%100101%100101%946. 0AT(%)100logTALmolbAc/1033. 65 . 11096. 9946. 053AT%ab(cm)c(mol/L)0.9469.961031.57 .15655.631096. 93Ma134.4.偏离朗伯偏离朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 标准曲线法测定未知溶液的浓标准曲线法测定未知溶液的浓度时，发现：标准曲线常发生弯曲度时，发现：标准曲线常发生弯曲（尤其当溶液浓度较高时），这种（尤其当溶液浓度较高时），这种现

13、象称为对现象称为对朗伯朗伯比耳定律的偏离。比耳定律的偏离。 引起这种偏离的因素（两大类引起这种偏离的因素（两大类) ) 物理性因素，即仪器的非理想引起的；物理性因素，即仪器的非理想引起的； 难以获得真正的纯单色光难以获得真正的纯单色光。 朗伯朗伯比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。比耳定律的前提条件之一是入射光为单色光。 分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致分光光度计只能获得近乎单色的狭窄光带。复合光可导致对朗伯对朗伯比耳定律的正或负偏离。比耳定律的正或负偏离。A=bc14假设由波长为假设由波长为1和和2的两单色光组成的入射光通过浓度为的两单色光组成的入射光通过浓度为c的的溶

14、液，则：溶液，则：bcIIAt11011)/lg(bcIIAt22022)/lg(bctbctIIII2110;10022011)()(lg210201ttIIIIA)1010()(lg2102010201bcbcIIIIA只有当只有当1= 2时，时，A = bc成直线关系，否则不成直线。成直线关系，否则不成直线。15为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。为克服非单色光引起的偏离，首先应选择比较好的单色器。此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸此外还应将入射波长选定在待测物质的最大吸收波长且吸收曲线较平坦处。收曲线较平坦处。 化学性因素化学性因素朗伯朗伯比耳定律的假定

15、：所有的比耳定律的假定：所有的吸光质点之间不发生相互作用；吸光质点之间不发生相互作用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 时，时，吸光质点间可能发生缔合等相互吸光质点间可能发生缔合等相互作用，直接影响了对光的吸收。作用，直接影响了对光的吸收。故：朗伯故：朗伯比耳定律只适用于稀溶液比耳定律只适用于稀溶液。16同时还应考虑溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物同时还应考虑溶液中存在着离解、聚合、互变异构、配合物的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸的形成等化学平衡时。使吸光质点的浓度发生变化，影响吸光度。光度。 例：例： 铬酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡：铬

16、酸盐或重铬酸盐溶液中存在下列平衡： 2CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中溶液中CrO42-、 Cr2O72-的颜色不同，吸光性质也不相的颜色不同，吸光性质也不相同。故此时溶液同。故此时溶液pH 对测定有重要影响。对测定有重要影响。17 8-2 光度计及其基本部件可见分光光度计可见分光光度计18紫外紫外-可见分光光度计可见分光光度计19一、吸光光度计的基本组成一、吸光光度计的基本组成光源光源单色器单色器吸收池吸收池检测器检测器显示显示参比池参比池1. 光源光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、

17、较好的稳定性、较长的使用寿命。的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在源，其辐射波长范围在3202500 nm。紫外区：氢、氘灯。发紫外区：氢、氘灯。发射射185400 nm的连续光的连续光谱。谱。202.2.单色器单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器；入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 光准直装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；光准直装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复

18、合光分解成单色光；色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅棱镜或光栅；聚焦装置：透镜或凹面反聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；聚焦至出射狭缝；出射狭缝。出射狭缝。准直镜准直镜入射狭缝入射狭缝213. 3. 样品室样品室样品室放置各种类型的吸收池（样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。区一般用玻璃池。4. 4. 检测器检测器 利用光电效应将透过吸收池利用光电效应将透过吸收池

19、的光信号变成可测的电信号，常的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍用的有光电池、光电管或光电倍增管。增管。5. 5. 结果显示记录系统结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理行仪器自动控制和结果处理22 8-3 显色反应及显色条件的选择 一、显色反应的选择一、显色反应的选择1.1.选择显色反应时，应考虑的因素选择显色反应时，应考虑的因素 灵敏度高灵敏度高(值值104105)、选择性好、生成物稳定、选择性好、生成物稳定、显色显色剂在测定波长处无明显吸收剂在测定波长处无明显吸收，两种有色物最大吸收波长之，两种有色物最大吸收波长之差

20、：差：“对比度对比度”，要求要求 60nm。2.2.配位显色反应配位显色反应 当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生当金属离子与有机显色剂形成配合物时，通常会发生电荷转移跃迁，产生很强的紫外电荷转移跃迁，产生很强的紫外可见吸收光谱。可见吸收光谱。 例如例如:Cu2+与双硫腙配位形成的双硫腙铜在与双硫腙配位形成的双硫腙铜在=533nm 处处的的=5104233. 3. 氧化还原显色反应氧化还原显色反应 某些元素的氧化态，如某些元素的氧化态，如Mn()、Cr() 在紫外或可见在紫外或可见光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显光区能强烈吸收，可利用氧化还原反应对待测离子进行显色后

21、测定。色后测定。 例如：钢中微量锰的测定，例如：钢中微量锰的测定，Mn2不能直接进行光度测不能直接进行光度测定定 2 Mn2 5 S2O82-8 H2O =2 MnO4- + 10 SO42- 16H+ 将将Mn2 氧化成紫红色的氧化成紫红色的MnO4- 后后，在在525 nm处进行测处进行测定。定。244.4.显色剂显色剂 无机显色剂：无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。硫氰酸盐、钼酸铵、过氧化氢等几种。 有机显色剂：有机显色剂：种类繁多种类繁多 偶氮类显色剂偶氮类显色剂：本身是有色物质，生成配合物后，颜色发本身是有色物质，生成配合物后，颜色发生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏

22、度高、选择性好、生明显变化；具有性质稳定、显色反应灵敏度高、选择性好、对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂对比度大等优点，应用最广泛。偶氮胂、PAR等等。 三苯甲烷类三苯甲烷类：铬天青铬天青S、二甲酚橙等、二甲酚橙等25二、显色反应条件的选择二、显色反应条件的选择1.显色剂用量显色剂用量 吸光度吸光度A与显色剂用量与显色剂用量CR的的关系会出现如图所示的几种情关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处况。选择曲线变化平坦处2.反应体系的酸度反应体系的酸度 在相同实验条件下，分别测定不同在相同实验条件下，分别测定不同pH值条件下显色值条件下显色溶液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦溶

23、液的吸光度。选择曲线中吸光度较大且恒定的平坦区所对应的区所对应的pH范围。范围。3.显色时间与温度显色时间与温度 实验确定实验确定4.溶剂溶剂 一般尽量采用水相测定，一般尽量采用水相测定，26三、共存离子干扰的消除三、共存离子干扰的消除1. 加入掩蔽剂加入掩蔽剂 选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽选择掩蔽剂的原则是：掩蔽剂不与待测组分反应；掩蔽剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的剂本身及掩蔽剂与干扰组分的反应产物不干扰待测组分的测定。测定。 例：测定例：测定Ti4，可加入，可加入H3PO4掩蔽剂使掩蔽剂使Fe3+(黄色黄色)成成为为Fe(PO)23-(无色无色)，消

24、除，消除Fe3+的干扰；又如用铬天菁的干扰；又如用铬天菁S光度光度法测定法测定Al3+时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将时，加入抗坏血酸作掩蔽剂将Fe3+还原为还原为Fe2+，消除消除Fe3+的干扰。的干扰。2. 选择适当的显色反应条件选择适当的显色反应条件 例如控制例如控制pH值值, 使显色剂不与干扰离子配合显色等。使显色剂不与干扰离子配合显色等。 3. 分离干扰离子：分离干扰离子：可采用可采用萃取萃取、沉淀、离子交换等方法。、沉淀、离子交换等方法。4. 选择适当的光度测量条件：选择适当的光度测量条件： 例如选择测量波长等。例如选择测量波长等。27 8-4 8-4 吸光度测量条件的选择1. 选择适当

25、的入射波长选择适当的入射波长 一般应该选择一般应该选择max为入射光波长。为入射光波长。 如果如果max处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低处有共存组分干扰时，则应考虑选择灵敏度稍低但能避免干扰的入射光波长。但能避免干扰的入射光波长。282. 选择合适的参比溶液选择合适的参比溶液 为什么需要使用参比溶液？为什么需要使用参比溶液？调节参比的调节参比的A=0，使测得的的吸光度真正反映待测物的吸光强，使测得的的吸光度真正反映待测物的吸光强度。扣除待测物的吸收之外的其他所有吸收。度。扣除待测物的吸收之外的其他所有吸收。 参比溶液的选择一般遵循以下原则：参比溶液的选择一般遵循以下原则： 若仅待测组

26、分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其若仅待测组分与显色剂反应产物在测定波长处有吸收，其它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水它所加试剂均无吸收，用纯溶剂（水) 作参比溶液；作参比溶液； 若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而若显色剂或其它所加试剂在测定波长处略有吸收，而试液试液其它组分其它组分无吸收，用无吸收，用“试剂空白试剂空白”(不加试样溶液不加试样溶液)作参比溶液；作参比溶液； 若待测试液若待测试液其它组分其它组分有吸收，但有吸收，但不与显色剂反应不与显色剂反应，则当显，则当显色剂无吸收，则可用色剂无吸收，则可用“试样空白试样空白”(直接用试样溶液直接用试样溶液)作参比溶作参比溶液

27、；当显色剂有吸收或参与显色反应，则可在试液中加入适液；当显色剂有吸收或参与显色反应，则可在试液中加入适当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。当掩蔽剂将待测组分掩蔽后再加显色剂，作为参比溶液。29显显-待待生成物生成物显色剂显色剂其他试其他试剂剂试样试样显显-共共存物存物选用的参比液选用的参比液溶剂（水）溶剂（水）试剂空白试剂空白试样空白试样空白掩蔽待测物后试掩蔽待测物后试样加显色液空白样加显色液空白参比溶溶液选择表参比溶溶液选择表注：注：“”表示在测量波长处有吸收表示在测量波长处有吸收“”表示在测量波长处没有吸收表示在测量波长处没有吸收303.3.控制适宜的吸光度（读数范围）控制适

28、宜的吸光度（读数范围）不同的透光度读数，产生的误差大小不同：不同的透光度读数，产生的误差大小不同： lgT=bc 微分：微分：- 0.434T -1 dT =b dc 两式相除得：两式相除得： dc/c = （ 0.434 / TlgT ）dT 以有限值表示可得：以有限值表示可得： c/c =（0.434/TlgT）T 浓度测量值的相对误差（浓度测量值的相对误差（c/c）不仅与仪器的透光度）不仅与仪器的透光度误差误差T 有关，而且与其透光度读数有关，而且与其透光度读数T 的值也有关。的值也有关。 是否存在最佳读数范围？何值时浓度测量值的相对误差是否存在最佳读数范围？何值时浓度测量值的相对误差最

29、小？最小？3101234560102030405060708090100C/C*100T%最佳读数范围与最佳值最佳读数范围与最佳值设：设：T =0.5%，则可绘出溶液，则可绘出溶液浓度相对误差浓度相对误差c/c与其透光度与其透光度T 的关系曲线。如图所示：的关系曲线。如图所示： 可求出浓度测量值的相对误差最小时的透光度可求出浓度测量值的相对误差最小时的透光度Tmin或吸光度或吸光度Amin为：为： Tmin36.8%, Amin0.434当：当：T =0.5%，T 在在20%65%之间时，之间时，即（吸光度即（吸光度 A =0.700.20）时，）时，浓度相对误差较小，浓度相对误差较小，为最佳

30、读数范围。为最佳读数范围。Tmin实际工作中应参考仪器说明书。实际工作中应参考仪器说明书。32 8-5 8-5 吸光光度法的应用一、普通分光光度法一、普通分光光度法1.1.单组分的测定单组分的测定 通常采用通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。标准曲线法定量测定。2.2.多组分的同时测定多组分的同时测定 若各组分的吸收曲线互不重叠，则可若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自最大吸收波长处分别进行测定。这在各自最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组分测定没有区别。本质上与单组分测定没有区别。 若各组分的吸收曲线互有重叠，则可若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸光度的加合性求解联立方程组得出根据吸光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。各组分的含量。 A1= a1bca b1bcb A2= a2bca b2bcb 33