酵母静止的细胞中的肌动蛋白体是一个可立即使用的肌动蛋白储备

1、酵母静止的细胞中的肌动蛋白体:一个可立即使用的肌动蛋白储备?大多数真核细胞在其生命的大多数时间处于一个静止的状态,准备特定的增殖信号。在酿酒酵母中,进入和退出静止状态仅仅取决于环境中的可利用的营养物质。从静止到增殖的转变不仅需要剧烈的代谢变化，还需要一个完整的多种细胞结构的重建。在这里,我们描述了一个酵母静止状态特异的肌动蛋白细胞骨架组织。当细胞停止分裂,肌动蛋白重组为一个我们称为“肌动蛋白体”的结构。我们的研究表明肌动蛋白体包括F-肌动蛋白和一些肌动蛋白结合蛋白，如丝束蛋白和成帽蛋白质。此外,通过与肌动蛋白斑或肌动蛋白线的对比,我们发现肌动蛋白体大多是固定的,并且我们没有发现任何肌动蛋白丝的

2、转换。最后,我们的研究表明,在细胞的再培养中肌动蛋白体迅速消失, 而且在蛋白质从头合成缺乏的情况下肌动蛋白线和斑可以被装配成肌动蛋白体。这使我们提出,肌动蛋白体是一个肌动蛋白的储备,它可以在再次进入一个增殖周期时为肌动蛋白线和斑的形成而迅速动员。介绍细胞生长和增殖的控制是生命的一个关键特性。大多数原核和真核细胞其最大部分的寿命是处于一个称为静止的非增殖状态。令人惊讶的是,一个关于多种细胞过程控制细胞增殖周期的巨大的信息体是可以利用的, 而生物学上的静止周期却鲜为人知。静止周期是细胞退出增殖周期的一个过程；进入并且维持一个稳定的,非增殖状态;最后,在特殊的环境条件下,又返回到细胞分裂周期。破解从

3、增殖到静止的转换机制是一个巨大而紧急的研究领域。在多细胞生物体,细胞增殖主要依赖于生长因子和激素,也可能依赖于涉及整个生物环境的参数。因此研究这些生物中的静止周期是非常具有挑战性的。相比之下,单细胞微生物如酿酒酵母的增殖“完全”取决于环境中营养物质的可用性,因此更适合研究涉及进入和退出静止周期的过程。在营养枯竭时,增殖的酵母细胞完成细胞周期,停止成长,并且进入静止状态作为不萌发的细胞。静止状态的正确建立显然涉及由一组复杂的级联信号,如TOR和RAS途径控制的活跃的过程。此外,酵母细胞进入静止将彻底地修改他们的新陈代谢。他们积累碳水化合物、聚磷酸盐,并且大大降低蛋白质的合成率。最近,DNA微阵列

4、分析表明,尽管在进入静止后大多数基因下调,然而一些特定基因的转录被诱导,此外,一些特殊的转录物在静止细胞中富集。因而,这些研究揭示了发生在进入静止状态时特定的表达谱的“重新编程”。在细胞水平上,酵母细胞进入静止状态后产生出一个厚厚的细胞壁,它赋予了细胞一个对温度、渗透压或化学压力更高的耐受性。此外,静止的酵母细胞显示为凝聚的染色体和点状的线粒体网络;然而, 在进入静止状态时其其他细胞结构潜在的重塑则很少为人所知。在肌动蛋白细胞骨架是最动态细胞装置之一,而且对于各种不同的细胞过程如细胞形态、迁移、极化、收缩、分裂或细胞内运输等都是至关重要的。对于协调微丝(肌动蛋白)快速组装和去组装及调节参与各种

5、结构如应力纤维或收缩环的形成等巨大数量的信号通路, 肌动蛋白网络是高度响应的。活跃的增殖酵母细胞显示三个包含F-肌动蛋白的结构:肌动蛋白丝,作为运输小泡,细胞器和信使rna的极向运输的道路; 内吞作用所需的肌动蛋白斑;肌动蛋白-肌球蛋白细胞动力环。一整套的保守的肌动蛋白结合蛋白(ABPs)紧密协调这些高度动态的包含f-肌动蛋白的结构的形成和维持。尽管许多研究描述了复杂的分子间相互作用的网络,这些相互作用在分裂活跃的酵母细胞中调节肌动蛋白细胞骨架,但是很少有人了解它在静止细胞中的组织作用。在这里,我们仔细地描绘了出芽酵母在进入和退出静止状态时肌动蛋白细胞骨架的重建。我们描述了一个静止细胞特异的肌

6、动蛋白细胞骨架组织,我们将其命名为“肌动蛋白体”。我们进一步解释了这一新结构的构成、定位和动态性。最后,我们证明了当补充营养使细胞退出静止状态时肌动蛋白体的命运。根据我们的数据,我们提出肌动蛋白体作为肌动蛋白储备,可以立即用于细胞进入下一个增殖周期。材料和方法菌株,培养基,和质粒菌株。除了特定的外, 在这项研究中所采用的所有的酿酒酵母菌株都是对BY4742或BY4741(以s288c为背景)等基因系的，来自于Euroscarf(Frankfurt,德国)并且如表1所列。携带绿色荧光蛋白(GFP)融合物的酵母菌株来自于英杰公司(Carlsbad,CA)。培养基。YPDA培养基如前所述。SD ca

7、sa培养基中补充1.8mM尿嘧啶、0.2 mM色氨酸和0.3 mM腺嘌呤。包含2%乳酸的培养基在Chateaubodeau等(1976)中有描述,而含N3甘油的培养基在Lefebvre-Legendre 等(2001)中有描述，在此基础上补充2%的乙醇。为了测试在营养匮乏时的可行性,我们使用一个含有0.1%的葡萄糖和赤藓红的SD casa WAV培养基，如Bonneu 等(1991)中所述。为了按时间顺序的老化试验，细胞在30下在液体YPDA培养基中生长7 d，然后将其连续稀释物种植在重复的YPDA培养基上。培养基的百分比是经过100%的生存的野生型菌株标准化的,并且是两个独立实验的平均值。质

8、粒。P2893是在ABP140编码序列位点的3末端集成了三个串联的GFP拷贝。P2932是在CAP2编码序列位点3末端集成了三个串联的GFP拷贝。这个CAP2-3xGFP融合蛋白是有功能的,即,不是与sac6合成致死的。P2934是在SAC6编码序列位点3末端集成了三个串联的GFP拷贝。SAC6-3xGFP融合蛋白是有功能的(即，不是与abp1合成致病的)。P3006是在ABP1编码序列位点3末端集成了三个串联的GFP拷贝。ABP1-3xGFP融合蛋白是有功能的(即,不是与sac6合成致病的)。详细的结构和基因序列可按要求提供。显微镜落射荧光显微镜。应用一个完全自动化的蔡司200M倒置显微镜来

9、观察细胞,该显微镜配有一个ms-2000载物台,一个Lambda LS 175 W氙气光源,一个100 *1.4数值孔径的高度消色物镜和五个位置的过滤塔。过滤数据集如下:对于 Alexa-phalloidin 568:Cy3(例:HQ535/50-Em:HQ610/75-BS:Q565lp),对于活细胞GFP:具有GFP 长通性(例:HQ470/40-Em:HQ500lp-BS:Q495lp),而对于固定细胞GFP 共区域化HQ异硫氰酸荧光素窄带 (例:HQ487/25-Em:HQ535/40-BS:Q505lp)。图像使用CoolSnap HQ相机拍摄。显微镜、相机和快门用SlideBook

10、软件处理。光漂白(FRAP)后的荧光恢复都使用了附加到显微镜的照明器部分的微点波长可调节激光系统。该系统使用了一个由光纤电缆耦合到显微镜的氮气脉冲激光器。非相干光使用香豆素蓝化学室进行同步化和放大,在440 nm波长下发出。同时的光漂白和荧光照明是通过使用一个分光镜(50%白光/ 50%激光)由荧光灯和激光束直接照射到显微镜的荧光器实现的。激光的XY定位是由两个计算机驱动的以电流计为基础的转向镜头控制的。一个12像素区域的荧光强度是在z-stacks最大投射的情况下测量的。荧光强度In按如下公式计算: In=(I感兴趣的区域-I背景)/(I对照区域-I背景)。荧光比率为I0/In。可参考Lue

11、deke 等(2005)。为了绿色荧光蛋白成像，酵母细胞种植在30°C下的有适当补充SD casa培养基中。为了延时生长细胞的显微,取2-2.5l的培养物于玻片上，并立即在室温(22)成像。使用Alexa-phalloidin 568(表达载体)的鬼笔环肽染色如先前描述。所有的照片(除了指定的以外) 都是通过0.3M 的Z步骤在Z-stacks的最大投射下获得的。电子显微镜。酵母细胞在30下于50毫升YPDA培养基中220 rpm摇床培养3d。细胞球被放置在电子显微镜铜网格(400网) 的表面，其上已涂有聚醋酸甲基乙烯脂。每个循环非常迅速地浸没在预冷的液体丙烷中，并且储存于-180液

12、氮中。然后循环被转移到预冷的0.1%戊二醛干燥的丙酮溶液中，在-82保存3 d。样品在-20用丙酮漂洗并逐步嵌入在LR Gold树脂中。树脂聚合物在-20经紫外光照射7 d。超薄LR Gold部分聚有涂镍的网格线。该部分首先在1mg/ml甘氨酸中温育5分钟，然后在胎牛血清(1:20)中温育5分钟。网格在室温下用稀释1/200的鼠抗肌动蛋白单克隆抗体温育45分钟,然后用Tris-缓冲液生理盐水漂洗:0.1%牛血清白蛋白，并且在室温下用连接于10nm金颗粒的抗小鼠免疫球蛋白IgG温育45分钟。这个部分是用蒸馏水漂洗,与2%醋酸双氧铀水溶液漂洗5分钟形成对比,紧接着用1%柠檬酸铅漂洗1分钟。标本用飞

13、利浦Tecnai 12 Biotwin(120千伏)电子显微镜观察。免疫印迹总蛋白提取物使用三氯乙酸及Reid和Schatz(1982)中描述的玻璃珠方法预处理。抗体是B·Goode送的。鸡的抗酵母肌动蛋白抗体使用1/5000的;鸡的抗酵母Abp1p抗体使用1/5000的;鸡的抗酵母Cap1/2p抗体使用1/2500的;鸡的抗酵母丝束蛋白(Sac6p)抗体使用1/5000的;鼠的抗Scp1p抗体使用1/1000的。连接有HRP的抗鸡和抗鼠的二级抗体使用1/10000的。杂项葡萄糖浓度是使用葡萄糖/果糖紫外线测试组件测定的。Latrunculin-A是B·Goode送的,且使

14、用浓度为200 m。放线菌酮使用的最终浓度是100 g/ml。结果静止的酵母细胞的肌动蛋白细胞骨架在身体内是有秩序的在这项研究中,我们选择遵循现行的Gray等(2004)提出的静止细胞的定义。并且以前用于转录组研究,也就是说,静止细胞是在30固定培养于富含葡萄糖的液体培养基中获得的。我们在培养于富含葡萄糖的培养基的野生型酵母细胞生长的不同阶段，模拟了酵母肌动蛋白细胞骨架的重组。如前面广泛描述的一样,活跃增殖的酵母细胞显示的肌动蛋白细胞骨架由三个含有F-肌动蛋白结构组成:肌动蛋白丝、肌动蛋图1. 在进入静止状态时的肌动蛋白细胞骨架重组。(A)野生型酵母细胞生长在30下YPDA中。细胞密度使用OD

15、600nm进行测量 (灰色线)。在不同的生长阶段,取样, 测定培养基中葡萄糖浓度 (灰色三角形),细胞用Alexa-phalloidin染色。对于每个时间点,具有极化肌动蛋白细胞骨架的细胞 (黑色虚线),具有去极化的肌动蛋白细胞骨架的细胞(空心方框),或具有肌动蛋白体的细胞(黑色曲线)都被计数(对于每个时间点n200)。萌芽指数(出芽细胞的比例)用黑色的圆圈显示(对于每个时间点n200)。(B)左侧的图片,在对数生长期(在A中时间点为3 h时)极化细胞的例子。中间的图片, 在两个阶段相互转变时(在A中时间点为6.5 h时)去极化细胞的例子。右侧的图片, 具有肌动蛋白体处于静止状态(在A中时间点

16、为72 h时)的细胞的例子。图像是二维的(2 d)三维(3d)图像叠加物的最大投影。比例尺,2m。(C)细胞进入静止状态时Abp1p,Act1p和Cap1/2p稳态水平的免疫印迹分析。时间点和与A中时间点对应的OD值。白斑和肌动蛋白细胞动力环。肌动蛋白丝和肌动蛋白斑的活动增长位点是被极化的 (处于胞质分裂的芽顶和芽颈;图1B，左)。在两阶段生长的转变中,对应于葡萄糖匮乏,肌动蛋白丝变得紊乱和肌动蛋白斑在细胞内去极化。然后, 肌动蛋白丝消失了,结构重建的肌动蛋白斑仍然是去极化的(图1 B，中)。最后,肌动蛋白斑消失了,然而一个我们称为肌动蛋白体的新的肌动蛋白组织出现了(图1B,右)。几小时内,我

17、们在大多数的细胞群中发现肌动蛋白体(图1A,黑色的曲线)。因为他们可以被鬼笔环肽染色,所以肌动蛋白体包含真实的F-肌动蛋白。肌动蛋白体没有一个特定的形状,他们可以是球形的或拉长的。当处于细长状态时,肌动蛋白体显示为多变的厚度和曲率。此外,每个细胞可以拥有一个或多个肌动蛋白体。典型的例子如图1B(右)所示。在整个稳定时期肌动蛋白细胞骨架仍然组织于肌动蛋白体内,而且我们能够在只生长2个月的细胞中观察到肌动蛋白体 (未发表过的数据)。基于这些观察,很明显在静止细胞中仍然存在巨大数量的F-肌动蛋白。稳态状态下总细胞肌动蛋白的水平始终不影响细胞的稳定状态(图1C)。值得注意的是, 在肌动蛋白细胞骨架重组

18、的不同阶段Abp1p ABPs和Cap1/2的数量并没有显著改变(图1C)。如图1A所示,肌动蛋白体产生于两个生长阶段相互转变后,当葡萄糖用尽时。因此我们提出这个特殊的肌动蛋白细胞骨架组织是否存在于细胞生长碳源缺乏时。如表2所示, 在含有乳酸或丙三醇/乙醇的培养基中生长了7d的细胞中发现有肌动蛋白体。最后, 在单倍体和二倍体细胞中都观察到了肌动蛋白体,并且是在多种压力背景下观察的(表3)。因此,肌动蛋白体定义为一个新的特异地发现于不增殖的酵母细胞中的肌动蛋白细胞骨架组织。肌动蛋白体不能定位到一个特定的细胞区域然后,我们解释了肌动蛋白体可能位于一个特定的亚细胞区的可能性。因此我们分别使用Ilv3

19、p-GFP、4,6-双脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和Pho88p-GFP比较了肌动蛋白体与线粒体、细胞核、内质网的位置关系。如图2 A所示,肌动蛋白体与线粒体和细胞核并不共区域，并且与任何特定的内质网地区都是不相关的。基于对生长于营养丰富的培养基中3 d的细胞的抗肌动蛋白抗体免疫胶体金染色的电子显微镜实验证实了这些结果。如图2B所示,抗肌动蛋白抗体聚集于电子轻度致密的结构。重要的是, 在指数增长的细胞中没有发现这些肌动蛋白抗体聚集物 (我们未发表过的数据)。基于它们大小、形状和位置的相似度,我们可以合理地得出这样的结论: 聚集的抗肌动蛋白抗体的结构是通过Alexa-鬼笔环肽染色由荧光显微镜观

20、察到的肌动蛋白体。这个实验证实,即使在超微结构水平，肌动蛋白体也不会定位于细胞质的特定区域。此外,我们可以观察到肌动蛋白体和细胞膜没有紧密的联系。图2. 肌动蛋白体的定位。(A)细胞内肌动蛋白体的定位。野生型酵母细胞表达的分别用Ilv3p-GFP(左)或Pho88p-GFP(右)标记的线粒体和内质网,该细胞在30下的SD casa培养基中生长7 d,然后固定,再分别用DAPI和Alexa-phalloidin染色。在合并后的底部图片,绿色是GFP -,蓝色是DAPI -,红色是Alexa-phalloidin染色的F-肌动蛋白。图像是二维的(2 d)三维(3d)图像叠加物的最大投影。比例尺,2

21、m。(B) 在生长在30下YPDA培养基中3 d的野生型酵母细胞中的连接于10nm金颗粒的抗肌动蛋白抗体的免疫胶体金定位。箭头指向金颗粒聚集物。在图像的右上角, 一个细胞内含有三个金颗粒聚集物，已被圈出。比例尺,500nm(顶部);200nm(底部)。一些肌动蛋白结合蛋白与肌动蛋白体共区域在活跃增殖的细胞中,大量肌动蛋白结合蛋白(ABPs) 与包含F-肌动蛋白的结构共区域。因此我们怀疑在静止细胞中一些ABPs是否定位于肌动蛋白体。29个融合有GFP的ABPs被检测了其在静止细胞中的位置(补充表1)。在它们中间，有6个显示与肌动蛋白体(Arc15p,Arc18p,Arc35p,Arp2p,Crn

22、1p,Srv2p)共处一个特殊的区域,5个与肌动蛋白体(Abp1p,Abp140p,Cap1p,Cap2p,Sac6p)完全地共处一个区域。Abp1p和Cap1p / Cap2p是只发现于肌动蛋白斑的ABPs, Abp140p是优先发现于肌动蛋白丝的一种蛋白质,而Sac6p在肌动蛋白丝和肌动蛋白斑中都检测到了。为了证实这些结果以及增加静止细胞中所需的GFP信号 ,我们构建了3倍的GFP融合蛋白并且显示为有功能的(见材料与方法)。如图3A所示，们个, Abp1p-3xGFP, Abp140p-3xGFP,Cap1p-GFP和Cap2p-3xGFP与肌动蛋白体共区域。Sac6p结果与之类似 (图3

23、 E)。因此, 在不增殖细胞中，我们在肌动蛋白丝和/或肌动蛋白斑中发现的蛋白质与肌动蛋白体共区域。肌动蛋白体作为紧密的包含F-肌动蛋白的结构,因此可能是由肌动蛋白结合蛋白维持的。Scp1p和Sac6p是两种酵母肌动蛋白结合蛋白,它们一起调节细胞增殖中肌动蛋白细胞骨架的稳定性和组织过程。因此我们问这两种蛋白是否也参与组织了静止细胞中的肌动蛋白细胞骨架。活跃增殖的scp1细胞显示一个野生型肌动蛋白细胞骨架组织，并且92±2%的scp1静止细胞在培养3 d后显示肌动蛋白体(图3B)。相比之下,sac6细胞在指数生长期和稳定期都存在一个强烈改变的肌动蛋白细胞骨架组织 (图3B)。重要的是,s

24、ac6细胞在衰退期和稳定期显示为生存能力降低(图3 C)。要注意的是, SCP1的删除没有显著加剧sac6的表型(见补充图1)。因此,很容易推测丝束蛋白/ Sac6p结合肌动蛋白的活跃性是维持稳定期肌动蛋白体所必须的,而钙调蛋白同系物Scp1p的活跃性则图3.(A) 肌动蛋白体与不同肌动蛋白结合蛋白的共区域化。野生型酵母细胞表达的不同的融合有三个串联的GFP拷贝的ABPs在自然水平下在30下的SD casa培养基中生长2 d。细胞用Alexa-phalloidin固定染色。在合并后的底部图片中,GFP显示为绿色,红色显示的是染有Alexa-phalloidin的F -肌动蛋白。图像是二维的(2

25、 d)三维(3d)图像叠加物的最大投影。 (B)在两个肌动蛋白结合蛋白突变体:sac6和scp1中肌动蛋白体的形成。野生型(左),scp1(中)和sac6(右)细胞在YPDA培养基中生长3d，然后用Alexa-phalloidin固定染色。比例尺,2m。 (C)肌动蛋白结合的突变体生存于衰退期和稳定期。连续的稀释物生长于常规的SD casa WAU培养基或含有casa WUA,0.1%葡萄糖和赤藓红的合成培养基，赤藓红是一种将死细胞染成粉红色的染料。显示了菌株在30下的YPDA培养基中生长7 d后的可育性。对可育性的检测如材料和方法中描述的一样。(D) Sac6p和Scp1p在不同生长阶段的稳

26、态水平。样本取于在30下的YPDA培养基中培养3d（3d）或7d(7 d)后的指数阶段的野生型细胞。(E)Scp1p 和Sac6p在稳定期的定位。表达Sac6p-GFP或Scp1p-GFP的酵母细胞被培养在30下的SD casa培养基中。左边的图显示生活在指数增长期的细胞中的GFP荧光。在其后的图片中显示, 在30下生长3d的细胞用Alexa-phalloidin固定染色。在合并的图片中,GFP显示为绿色, Alexa-phalloidin染色的F-肌动蛋白显示为红色。图像是二维的(2 d)三维(3d)图像叠加物的最大投影。比例尺,2m。不是必须的。与此一致的是,Sac6p在稳定期的稳态水平保

27、持稳定,而Scp1p在衰退期的稳态水平强烈降低(图3D)。最后,而在指数增长期的细胞中Scp1-GFP和Sac6p-GFP都能被检测到,在不增殖的细胞,Sac6p-GFP与肌动蛋白体共区域，但检测不到Scp1-GFP信号,这与根据这种蛋白质的稳态水平所预期的一样(图3E)。肌动蛋白体是稳定的结构在酵母中，在增殖细胞中观察到的包含F-肌动蛋白的结构是高度动态的。在这些结构内部,蛋白质交换非常动态,并且在形成肌动蛋白丝和肌动蛋白斑的单纤维中肌动蛋白的转换是非常快速的。事实上,肌动蛋白斑是非常短暂的结构,其半衰期估计是20-40秒。与此一致的是,在活细胞中, 在latruculin A(lat-A)

28、处理下肌动蛋白单纤维迅速消失, lat-A是一种可以防止G-肌动蛋白聚合的药物。因此,我们使用lat-A来估计肌动蛋白单纤维在体内的转换。正如所料,在活跃增殖的细胞中,一个200Mlat-A的处理引起所有含有F-肌动蛋白的结构(肌图4.包含稳定肌动蛋白单纤维的肌动蛋白体。(A)肌动蛋白体对latrunculinA(A)存在抗性。野生型细胞生长在30下的YPDA培养基中。在指数增长(上部)或者培养3d(底部)期间,细胞在200M lat-A或二甲亚砜中温育5分钟或2 h作为对照。然后细胞用Alexa-phalloidin固定染色。(B)在具有单个肌动蛋白体的细胞中肌动蛋白体的Abp1p-3xGF

29、P信号激光烧蚀后的荧光恢复。表达Abp1p-3xGFP的野生型细胞在30下的SD casa培养基中生长3 d。左边的图像是三维图像延时系列最大的二维投影。时间显示在左上角。白色的小圆圈标出了漂白区域。右边的图表显示了从10个不同的细胞获得的荧光动力学过程。同样的曲线是从32个细胞中获得的。(C) 在具有两个肌动蛋白体的细胞中肌动蛋白体的Abp1p-3xGFP信号激光烧蚀后的荧光恢复。表达Abp1p-3xGFP的野生型细胞在30下的SD casa培养基中生长3 d。左边的图像是三维图像延时系列最大的二维投影。时间显示在左上角。白色的小圆圈标出了漂白区域；虚线框表示相同细胞中未漂白的肌动蛋白体。右

30、边的图显示了测量漂白(黑点)和未漂白(打开的方框)区域的荧光动力学过程。同样的曲线是从12个不同的细胞中获得的。(D) 半个肌动蛋白体的Abp1p-3xGFP信号激光烧蚀后的荧光恢复。表达Abp1p-3xGFP的野生型细胞在30下的SD casa培养基中生长3 d。左边的图像是三维图像延时系列最大的二维投影。时间显示在左上角。白色的小圆圈标出了漂白区域；虚线框表示相同肌动蛋白体的未漂白区域。右边的图显示了测量漂白(黑点)和未漂白(打开的方框)区域的荧光动力学过程。同样的曲线是从14个不同的细胞中获得的。比例尺,2m。动蛋白丝、肌动蛋白斑和胞内动力环)在5分钟内都消失(图4A,顶部)。相比之下,

31、对生长了3或7 d的细胞,同样的处理并不影响肌动蛋白体,即使是在存在长时间的潜伏药物处理后(图4A,顶部，及补充图2)。因此,对于lat-A处理肌动蛋白体比酵母中其他任何已知的包含F-肌动蛋白的结构更具有耐受性。然后,我们想知道定位于肌动蛋白体的ABPs池是否是动态的。为了这个目的,我们使用FRAP研究了Abp1p-3xGFP在肌动蛋白体中的转换。因为Abp1-3xGFP的恢复反映了Abp1p-3xGFP在肌动蛋白体内或与Abp1p-3xGFP胞质池的交换,这揭示了肌动蛋白体动态性。对生长3d的细胞中的肌动蛋白体进行光学漂白,甚至在30分钟后,都没有明显的Abp1-3xGFP恢复被检测到。这是

32、真实的,不仅当一个肌动蛋白体完全漂白时,在细胞中显示一个或两个分开的肌动蛋白体(分别为0/32和0/12个细胞;图4,B和C),而且当一个肌动蛋白体部分漂白时,情况也相同(0/14;图4D)。总之,没有检测到Abp1-3xGFP交换,这强烈说明没有明显的Abp1-3xGFP胞质池和/或Abp1p-3xGFP在一个肌动蛋白体是不移动的。我们使用Sac6p-3xGFP也得到了类似结果(我们的未发表过的数据)。此外, 在图4B-D中可以观察到,肌动蛋白体在细胞中一般是不移动的。这些数据表明,肌动蛋白体是稳定的和不移动的结构,在此结构中肌动蛋白单纤维和ABPs间的转换是非常缓慢的。细胞再饲养时肌动蛋白

33、体迅速消失在不增殖的细胞中,肌动蛋白体表现为稳定的结构。因此我们想知道当细胞退出静止状态并再次进入增殖细胞周期时,肌动蛋白体是怎样重组的。为了解决这个问题, 在营养丰富的培养基中培养了一个生长到稳定期(7d)的野生型酵母细胞,然后细胞被稀释到新鲜的培养基中,并且通过肌动蛋白鬼笔环肽染色来观察肌动蛋白细胞骨架的重组。如图5A所示, 细胞再饲养后5分钟内,大于50%的肌动蛋白体消失了,而去极化的肌动蛋白丝和肌动蛋白斑重新出现。细胞再饲养2 h后,这些结构出现全极化和芽萌发。为了更精确的观察肌动蛋白体的消失,我们使用野生型酵母细胞表达Abp1p-3xGFP,该细胞生长2 d,然后在短暂离心后稀释到新

34、鲜培养基中,并且立即成像。如图5B和补充图片S1和S2所示, 再饲养4分钟后, 产生了高度能动的Abp1-3xGFP小点，同时在大多数细胞中,肌动蛋白体也随之消失了。表达Sac6p-3xGFP的细胞中也得到了相似的结果 (图5 B，底部，及补充图片S3),并且当细胞被转移到水中而不是新鲜培养基时，我们没有观察到肌动蛋白体组织中的改变(我们的未发表过的数据)。当在再饲养之前细胞用200M的lat-A处理时,大多数肌动蛋白体在15分钟内消失了。与未经处理的细胞相比,没有肌动蛋白斑随之出现(图5C,补充图片S4和补充表3)。我们的结论是,肌动蛋白体在没有任何肌动蛋白单纤维转换的情况下不能直接引起肌动

35、蛋白斑产生。图5. 在退出稳定期时肌动蛋白细胞骨架的重组。(A)野生型细胞在30下的YPDA培养基中生长7d。然后，细胞在新鲜的YPDA培养基中清洗重悬，并且在30下生长。通过测量OD600nm(灰色线)来监测细胞密度。对于每个时间点,细胞用Alexa-phalloidin染色。具有极化的肌动蛋白细胞骨架(深灰色柱)、 去极化的肌动蛋白细胞骨架(浅灰色柱)和肌动蛋白体(灰色柱)的细胞被计数(n200;SD5%)。萌芽指数(出芽细胞的比例) 用黑点显示 (n200;SD5%)。(B) 生长于30下SD casa培养基中2d的野生型酵母细胞表达的Abp1p-3xGFP(上部)和Sac6-3xGFP

36、(下部)。经短暂离心后,细胞颗粒在新鲜培养基中重悬并立即成像。图像是三维图像延时系列最大的二维投影。培养基更新后时间以分钟计，显示在左边角落。比例尺,2m。(C) 表达Abp1p-3xGFP的野生型酵母细胞在30下的SD casa培养基中生长3 d。细胞集中培养并且在最后浓度为200M时添加Lat-A。这一集中培养在30下温育30分钟。在温育后,20l的细胞悬液混合于含有200MLat-A(上部)的20l的水中或含有200MLat-A的20l2倍的新鲜SD casa培养基中,并立即成像(底部的两个图片)。图像是三维图像延时系列最大的二维投影。加入包含lat-A的水或新鲜培养基后时间以分钟计，显

37、示在左边角落。比例尺,2m。肌动蛋白体消失及肌动蛋白丝和肌动蛋白斑的形成可以发生在蛋白质合成匮乏时期为了进一步洞察肌动蛋白斑和肌动蛋白丝在肌动蛋白体分解时的再发生的机理,我们观察了在存在放线菌酮的细胞再饲养时的肌动蛋白体重组, 放线菌酮是一种防止蛋白质合成的药物。细胞生长7 d,然后转移到包含100g/ml放线菌酮的水、YPDA或YDPA。这个浓度的放线菌酮抑制蛋白质合成甚至在生长到稳定期的细胞中也有效果。然而,为了进一步确定放线菌酮的效果，在包含放线菌酮的YPDA再饲养之前，处理的细胞用药物预培养1h。如图6A所示,然而肌动蛋白体没有受到将细胞转移到水中的影响,当这些细胞被转移到含有或不含放

38、线菌酮的YPDA中,肌动蛋白体迅速消失，并且去极化的肌动蛋白丝和肌动蛋白斑也出现了(例如,见图6B)。然而,这些结构的极化完全被放线菌酮抑制 (图6,A和B)。总之,肌动蛋白体重组为肌动蛋白丝和肌动蛋白斑可以在缺乏蛋白质从头合成途径的细胞中发生。讨论在特定信号下肌动蛋白细胞骨架重组是细胞生命的重要方面的基础,如极化的胞内运输,细胞迁移或细胞分裂。在这里,我们已经描述了一个新的肌动蛋白细胞骨架组织,肌动蛋白体,特别是出现在酵母细胞进入静止周期时。在静止过程中这些结构一直保持，并且在细胞再次进入增殖周期时这些结构快速分解。肌动蛋白体必须与在一些酵母突变株中描述的肌动蛋白带区分开,这些突变株显示为肌

39、动蛋白细胞骨架组织缺陷。肌动蛋白带只能使用抗肌动蛋白抗体检测。相比之下,肌动蛋白体可以被荧光标记的鬼笔环肽染色,表明这些结构包含真实的F-肌动蛋白单纤维。此外,在此前的一项研究中, 培养了28 d的静止的酵母细胞有一个肌动蛋白“块”的表型, 并且突变体，如prs3,whi2, end3,sla1报道显示在稳定期早期有肌动蛋白“团”。尽管如此,这些结构没有被进一步研究,并且到目前为止,没有在进入静止状态的酵母中的肌动蛋白细胞骨架重组的精确描述(组成、动力学等)被发表。在此,我们的研究显示, 当野生型细胞停止增殖时肌动蛋白体大规模地产生,而与此同时肌动蛋白丝和肌动蛋白斑消失。嵌入肌动蛋白体的F-肌

40、动蛋白单纤维既可以是“老”的“回收”于肌动蛋白丝和/或肌动蛋白斑的肌动蛋白单纤维，也可以由肌动蛋白成核剂从头合成。这种成核剂可能是一个特定的和但不确定的肌动蛋白体单纤维成核剂。或者,它可能是一个以前描述过的酵母肌动蛋白成核剂,如Arp2/3复合物或形成素,这些成核肌动蛋白单纤维分别组装成丝或斑。因为这种成核剂的失活防止了酵母增殖,解决了有这些分子机制参与的肌动蛋白体的形成是重要的。与肌动蛋白丝和肌动蛋白斑相比,肌动蛋白体单纤维转换似乎非常缓慢(图4A)。是什么导致这种运动的观察的缺陷?这个问题也就是说肌动蛋白体是如何维持的?两个不相互排斥的可能性可以设想为:要么单纤维的转换是通过肌动蛋白本身(

41、或其相关的核苷酸)的修改减少的,要么单纤维是由ABPs严格维持的。这些ABPs或者是肌动蛋白体特异的，或者是基本的ABPs, 在稳定期它们将被特异的修改以防止F-肌动蛋白的转换。我们这里显示,在静止状态的细胞中,一些肌动蛋白结合蛋白与肌动蛋白体共区域。在这些ABPs间,成帽蛋白已被证明可以阻止肌动蛋白单纤维带刺的末端以及减小单纤维的分解率。同样,肌动蛋白单纤维结合蛋白Sac6p(丝束蛋白同源物)也与肌动蛋白体共区域。此外,Sac6p似乎是形成和/或维持肌动蛋白体所需要的(图3 B)。因此,至少有两个减少肌动蛋白单纤维转换的蛋白可能是肌动蛋白体形成和/或维持过程所涉及的。事实上,肌动蛋白单纤维转

42、换在稳定期是特异减少的，这可能是肌动蛋白体活跃形成的结果。相比之下,我们也可以设想, 单纤维转换的减少特异地诱导被动进入稳定期，从而导致肌动蛋白体的形成。的确,之前就有报道称当生长到稳定期早期时act1-157细胞(一种具有增加肌动蛋白动力特性的肌动蛋白等位基因)显示比对应的野生型细胞中具有更少的肌动蛋白块。在分子水平上,稳定期肌动蛋白体形成和/或维护的解释等待这些过程特异受损的突变体的发现。我们的试图发现这种突变体的研究揭示,在23个可用的ABP的缺失突变体中,只有arc18和sac6在稳定期表现出明显的肌动蛋白细胞骨架的改变 (补充表2)。然而,事实上,这些突变体已经显示在活跃增殖的细胞中一个改变了的肌动蛋白细胞骨架组织使在进入静止状态时他们对肌动蛋白细胞骨架重组的特定影响的解释相当微妙。此外,进入稳定期是一个缓慢的过程,到目前为止,尽管我们的研究取得了很大的进展,但我们没有发现任何其他实验方法用以诱导肌动蛋白体的形成。这种高度复杂的信号级联反应的解码导致在进入静止状态时肌动蛋白细胞骨架的重组。因为在细胞再饲养时肌动蛋白体迅速并且同步地消失 (图5),所以研究导致肌动蛋白体分解的信号可能是一