11免疫印迹技术

1、第第1111讲讲免疫印迹技术免疫印迹技术 雕版印刷是最早在中国出现的印刷形式，在雕版印刷是最早在中国出现的印刷形式，在印刷史上有印刷史上有“活化石之称，扬州是中国雕版印活化石之称，扬州是中国雕版印刷术的发源地，是中国国内唯一保存全套古老雕刷术的发源地，是中国国内唯一保存全套古老雕版印刷工艺的城市。版印刷工艺的城市。 雕版印刷术是一种具有突出价值且民族特征雕版印刷术是一种具有突出价值且民族特征鲜明、传统技艺高度集中的人类非物质文化遗产。鲜明、传统技艺高度集中的人类非物质文化遗产。它凝聚着中国造纸术、制墨术、雕刻术、摹拓术它凝聚着中国造纸术、制墨术、雕刻术、摹拓术等几种优秀的传统工艺，最终形成了这

2、种独特文等几种优秀的传统工艺，最终形成了这种独特文化工艺；它为后来的活字印刷术开了技术上的先化工艺；它为后来的活字印刷术开了技术上的先河，是世界现代印刷术的最古老的技术源头。河，是世界现代印刷术的最古老的技术源头。根本内容根本内容免疫印迹技术的原理免疫印迹技术的原理1基本操作流程基本操作流程2注意事项注意事项3免疫印迹技术的应用免疫印迹技术的应用4课堂小结课堂小结5作业作业6 电泳结果检查电泳结果检查电泳电泳测定蛋白样品浓度测定蛋白样品浓度 收集或提取蛋白样品收集或提取蛋白样品二、根本操作流程二、根本操作流程1、SDS-PAGE1 1、SDS-PAGESDS-PAGE 收集或提取蛋白样品收集或

3、提取蛋白样品 可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。浮细胞或组织样品。 对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDSSDS上样上样缓冲液缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白。，裂解能力强，能提取细胞总蛋白。 另外，常用的还有另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解非离子去垢剂缓冲液裂解法，低渗缓冲液裂解法法，低渗缓冲液裂解法。可以参考相关文献提取。可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒

4、试剂盒进行抽进行抽提提. .二、根本操作流程二、根本操作流程1 1、SDS-PAGESDS-PAGE 收集或提取蛋白样品收集或提取蛋白样品 测定蛋白样品浓度测定蛋白样品浓度 一般来说有三种方法：第一种是采用一般来说有三种方法：第一种是采用定量试剂盒定量试剂盒；第二种是采用；第二种是采用光学检测法光学检测法；第三种直接跑第三种直接跑SDS-PAGESDS-PAGE。二、根本操作流程二、根本操作流程1 1、SDS-PAGESDS-PAGE 收集或提取蛋白样品收集或提取蛋白样品 测定蛋白样品浓度测定蛋白样品浓度 电泳电泳 配制配制SDS-PAGESDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品凝胶，在收集的蛋

5、白样品中参加上样缓冲液，点样后接通电源开始中参加上样缓冲液，点样后接通电源开始电泳。电泳。 利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应将不同分子量大小的蛋白质别离。应将不同分子量大小的蛋白质别离。二、根本操作流程二、根本操作流程1 1、SDS-PAGESDS-PAGE 收集或提取蛋白样品收集或提取蛋白样品 测定蛋白样品浓度测定蛋白样品浓度 电泳电泳 电泳结果检查电泳结果检查 考马斯亮蓝使用简便快速，是最经济通用的考马斯亮蓝使用简便快速，是最经济通用的蛋白蛋白PAGEPAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多。可是由于分辨率高

6、很多。可是由于考马斯亮蓝染色或者银考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Western BlotBlot实验，实验，很多人会选择省略掉这一步。很多人会选择省略掉这一步。 同样的样品同样的样品跑跑2 2块胶，一块染色一块转膜块胶，一块染色一块转膜，一，一般也可以说明问题。般也可以说明问题。二、根本操作流程二、根本操作流程2 2、抗原转移、抗原转移 通常有两种方法：毛细管印迹法通常有两种方法：毛细管印迹法转移效率较低和电泳印迹法常转移效率较低和电泳印迹法常用。用。 电泳印迹法电泳印迹法-用有空的塑料盒有用有空的塑料盒有机玻璃板将凝胶

7、和硝酸纤维素膜夹成机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治状，而后浸入两个平行电极三明治状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。在硝酸纤维素膜上。二、根本操作流程二、根本操作流程2、抗原转移、抗原转移2 2、抗原转移、抗原转移 转移膜的选择转移膜的选择 Western Blot Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜纤维素膜NCNC和偏二氟乙烯和偏二氟乙烯(PVDF(PVDF膜，此外也膜，此外也有用尼龙膜、有用尼

8、龙膜、DEAEDEAE纤维素膜做蛋白印迹。纤维素膜做蛋白印迹。膜的选择根据：膜的选择根据：a.a.膜与目的蛋白分子的结合能力也就是单位面膜与目的蛋白分子的结合能力也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量，以及膜的孔径也积的膜能结合蛋白的载量，以及膜的孔径也就是拦截蛋白的大小；就是拦截蛋白的大小；b.b.不影响后续的显色检测也就是适和用于所选不影响后续的显色检测也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好；的显色方法，信噪比好；c.c.如果后继实验有其他要求，比方要做蛋白测序如果后继实验有其他要求，比方要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。转

9、移膜。二、根本操作流程二、根本操作流程2 2、抗原转移、抗原转移 NCNC膜简介膜简介 硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力强，适用于各种显色方法包括同位素，强，适用于各种显色方法包括同位素，化学发光、常规显色、染色和荧光显色，化学发光、常规显色、染色和荧光显色，背景低，性价比高；使用也很简便不需背景低，性价比高；使用也很简便不需要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而且容易封闭，也不需要特别

10、严谨的清洗条且容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。转移到件。转移到NCNC膜上的蛋白在适宜的条件膜上的蛋白在适宜的条件下可以稳定保存很长时间。下可以稳定保存很长时间。 二、根本操作流程二、根本操作流程优优2 2、抗原转移、抗原转移 NCNC膜简介膜简介 但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不适合用于需要屡次重复清洗的用途。选择适合用于需要屡次重复清洗的用途。选择硝纤膜时要注意的是选择适宜的孔径，通硝纤膜时要注意的是选择适宜的孔径，通常常20KD20KD以上的大分子蛋白用以上的大分子蛋白用0.45um0.45um孔径的孔径的膜，小于膜，小于20KD20KD的话建议

11、选择的话建议选择0.2um0.2um的，如的，如果小于果小于7KD7KD的话最好选择的话最好选择0.1um0.1um的膜。的膜。二、根本操作流程二、根本操作流程缺缺3 3、封闭、封闭 电泳转移后，固相纸膜上还留有电泳转移后，固相纸膜上还留有无蛋白组分结合的区域，在对蛋白质无蛋白组分结合的区域，在对蛋白质进行专一性检测的时候，由于免疫学进行专一性检测的时候，由于免疫学检测试剂中的蛋白质抗体，在与检测试剂中的蛋白质抗体，在与特异性抗原结合的同时也会非特异的特异性抗原结合的同时也会非特异的结合固相上的空白区域，产生高背景，结合固相上的空白区域，产生高背景，导致检测结果不明显，因此要对这些导致检测结果

12、不明显，因此要对这些空白区域进行封闭。空白区域进行封闭。 最常用的封闭剂就是脱脂奶粉。最常用的封闭剂就是脱脂奶粉。二、根本操作流程二、根本操作流程各种常见的封闭剂各种常见的封闭剂4 4、免疫检测、免疫检测 把已经封闭过的膜放入参加抗体把已经封闭过的膜放入参加抗体的缓冲液中，对特异性的靶抗原进行的缓冲液中，对特异性的靶抗原进行检测。检测。 这个过程通常会发生多步反响，这个过程通常会发生多步反响，一般采用间接检测法，常用的检测系一般采用间接检测法，常用的检测系统有放射性同位素、酶、荧光素等，统有放射性同位素、酶、荧光素等，通过放射自显影或显色反响检测抗原通过放射自显影或显色反响检测抗原- -抗体复

13、合物，从而到达对蛋白质进行抗体复合物，从而到达对蛋白质进行特异性检测和鉴别的目的。特异性检测和鉴别的目的。二、根本操作流程二、根本操作流程原 理 流 程 图三、本卷须知三、本卷须知1 1 免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对含量。因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白，含量。因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白，只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细胞相比蛋白的含量是高还是低。胞相比蛋白的含量是高还是低。2 2 比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞不同条件下的相对含量时，

14、各样品的总蛋白量必不同条件下的相对含量时，各样品的总蛋白量必须相等。须相等。3 3 选用适宜的选用适宜的SDS-PAGESDS-PAGE胶浓度，使目的蛋白可胶浓度，使目的蛋白可以得到较好的分辨。以得到较好的分辨。4 4 开始电泳和转移膜时，一定要确认电极的正开始电泳和转移膜时，一定要确认电极的正负极接头是否正确。负极接头是否正确。5 5 在免疫检测中，要注意封闭非特异性结合位在免疫检测中，要注意封闭非特异性结合位点。点。6 6 抗体反响在封口塑料袋内进行，一定要驱除抗体反响在封口塑料袋内进行，一定要驱除袋内的所有气泡，否那么会导致抗体结合不均匀。袋内的所有气泡，否那么会导致抗体结合不均匀。7

15、7 操作要轻柔，带手套，不要再转移膜上造成操作要轻柔，带手套，不要再转移膜上造成任何刮痕。在整个操作中，转移膜要始终在液体任何刮痕。在整个操作中，转移膜要始终在液体中，不能枯燥。中，不能枯燥。三、本卷须知三、本卷须知四、四、Western-blottingWestern-blotting的应用的应用3 3个例子个例子 目前，目前，WesternWestern印迹法主要用于未知蛋印迹法主要用于未知蛋白质的检测及抗原组分、抗原决定簇的分白质的检测及抗原组分、抗原决定簇的分子生物学的测定；同时也可用于未知抗体子生物学的测定；同时也可用于未知抗体的检测和单克隆抗体的鉴定等。的检测和单克隆抗体的鉴定等。

16、 很多疾病在不同的发病阶段，即使临很多疾病在不同的发病阶段，即使临床上还没有明显的病症，在蛋白质水平就床上还没有明显的病症，在蛋白质水平就发生了变化，这些变化有可能成为临床早发生了变化，这些变化有可能成为临床早期的诊断指标。免疫印迹可以用于疾病的期的诊断指标。免疫印迹可以用于疾病的早期诊断和预后的跟踪分析检测。早期诊断和预后的跟踪分析检测。艾滋病确实诊检测例艾滋病确实诊检测例1 1艾滋病的临床病症艾滋病的临床病症持续发热、乏力、腹泻、食欲不振、体重下降、持续发热、乏力、腹泻、食欲不振、体重下降、夜间盗汗、全身淋巴结肿大、精神抑郁、表夜间盗汗、全身淋巴结肿大、精神抑郁、表情冷淡呈慢性病容，以及由

17、于机体抵抗力低情冷淡呈慢性病容，以及由于机体抵抗力低下，出现一些不常见的条件致病菌感染或时下，出现一些不常见的条件致病菌感染或时机感染性疾病的病症。机感染性疾病的病症。四、四、Western-blottingWestern-blotting的应用的应用艾滋病的诊断标准艾滋病的诊断标准 艾滋病病毒抗体阳性，又具有下述任何一项者，艾滋病病毒抗体阳性，又具有下述任何一项者，可为实验确诊艾滋病病人。可为实验确诊艾滋病病人。 1)1)近期内近期内(36(36个月个月) )体重减轻体重减轻10%10%以上，且持以上，且持续发热续发热3838达达1 1个月以上。个月以上。2)2)近期内近期内(36(36个月

18、个月) )体重减轻体重减轻10%10%以上，且持以上，且持续腹泻续腹泻( (每日每日3535次次)1)1个月以上。个月以上。 3)3)卡氏肺囊虫肺炎卡氏肺囊虫肺炎(P.C.P)(P.C.P)。4)4)卡波西肉瘤卡波西肉瘤(K.S.(K.S.病症是胳膊上或者腿上出病症是胳膊上或者腿上出现紫色斑块现紫色斑块) )。5)5)明显的霉菌或其它条件致病菌感染。明显的霉菌或其它条件致病菌感染。四、四、Western-blottingWestern-blotting的应用的应用大鼠出生前后心肌端粒酶逆转录酶表达的变化大鼠出生前后心肌端粒酶逆转录酶表达的变化例例2 2 目的：探讨大鼠心肌组织端粒酶逆转录酶的发

19、育目的：探讨大鼠心肌组织端粒酶逆转录酶的发育规律。方法：免疫组织化学和免疫印迹技术检测规律。方法：免疫组织化学和免疫印迹技术检测SDSD大鼠心肌端粒酶逆转录酶大鼠心肌端粒酶逆转录酶TERTTERT的表达，图的表达，图像分析技术对心肌组织像分析技术对心肌组织TERTTERT的表达进行定量分析。的表达进行定量分析。结果：结果：3 3组大鼠心肌组织中的心肌细胞、平滑肌组大鼠心肌组织中的心肌细胞、平滑肌和内皮细胞均有和内皮细胞均有TERTTERT的表达。的表达。TERTTERT主要位于细胞主要位于细胞质和细胞核内。质和细胞核内。TERTTERT的总表达规律是的总表达规律是20d20d胎鼠阳胎鼠阳性表达

20、强于出生后性表达强于出生后6d6d大鼠，出生后大鼠，出生后12d12d大鼠心肌大鼠心肌表达最低，表达最低，3 3组之间组之间TERTTERT的组间比较差异有统计的组间比较差异有统计学意义。学意义。结论：大鼠心肌组织的端粒酶活性随着日龄增加，结论：大鼠心肌组织的端粒酶活性随着日龄增加，其表达逐渐减少。其表达逐渐减少。四、四、Western-blottingWestern-blotting的应用的应用蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达蛋白质免疫印迹技术检测肺癌组织上皮钙粘蛋白的表达例例3 3目的：探讨上皮钙粘蛋白目的：探讨上皮钙粘蛋白(E-cad)(E-cad)与肺癌及其病理类型与肺癌及其病理类型之间的相关性之间的相关性. .方法：应用蛋白质免疫印迹技术检测方法：应用蛋白质免疫印迹技术检测3030例肺癌患者的癌、例肺癌患者的癌、癌旁和远癌肺组织及癌旁和远癌肺组织及5 5例肺良性对照标本中例肺良性对照标本中E-cadE-cad的表的表达达, ,并对局部表达阴性的标本用免疫组化方法进行验并对局部表达阴性的标本用免疫组化方法进行验证证. .结果：癌组织、