结直肠癌转移差异分泌蛋白质组学研究

1、结直肠癌转移差异分泌蛋白质组学研究    结直肠癌是严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤。2008年,美国结直肠癌的发病率和死亡率在男、女性中均列恶性肿瘤的第三位。数十年来,随着我国人民生活方式和膳食结构的改变,结直肠癌的发病率和死亡率也呈逐年上升的趋势。虽然现代癌症研究和医疗技术不断发展,结直肠癌患者的预后并没有明显改善。转移是影响结直肠癌患者治疗效果和导致死亡的主要原因。因此,研究转移发生过程中的关键分子,早期预测结直肠癌的转移潜能,是提高结直肠癌患者生存率的关键。目前医疗界公认,检测肿瘤标志物是实现肿瘤转移预测的最佳手段。二十余年以来,在分子生物学和免疫

2、学检测技术不断发展的带动下,已有不少重要的肿瘤标志物如癌胚抗原、甲胎蛋白、前列腺特异性抗原等被开发应用。虽然这些肿瘤标志物已经广泛应用于临床诊断和病情监测。但遗憾的是,它们的敏感性和特异性却往往不尽人意。寻找更加敏感和特异的肿瘤标志物势在必行。在后基因组时代,逐渐发展成熟的蛋白质组学技术使得大规模的肿瘤标志物筛选成为可能。但是,传统的组织蛋白质组学策略在应用于肿瘤标志物筛选方面存在缺陷。因为,理想的肿瘤标志物理应能够从血液或尿液中被无创性的方法检测出来,而通过组织蛋白质组学策略筛选得到的肿瘤相关分子却不一定能满足这一基本要求。与之相对,近年来兴起的血蛋白质组学策略更加诱人,因为其可以通过对血中

3、蛋白表达谱的比较而直接获取肿瘤相关的血清标志物。不过,该策略却有其难以逾越的技术障碍。这是因为,血液的成份非常复杂,其中大量高丰度蛋白的存在会对其它重要蛋白产生致命的掩盖效应,从而大大降低血蛋白质组学筛选的效能。所以,现在越来越多的研究者开始关注一个全新的领域一肿瘤分泌蛋白质组学。分泌蛋白质组这一概念最早是由Tjalsma等于2000年在对枯草杆菌分泌蛋白的研究中提出的。从广义上说,分泌蛋白质组是指细胞、组织或器官释放到胞外的全部蛋白质,既包括由经典的蛋白分泌途径所分泌的蛋白质,也包括非经典分泌性蛋白质,还包括通过胞外体(exosome)分泌的蛋白质。肿瘤的形成是一个长期的多因素参与的复杂过程

4、,在该过程中,肿瘤细胞能够分泌多种蛋白质;这些蛋白质不仅能够以自分泌、旁分泌的形式调控肿瘤的发生和发展,还可以进入血液、尿液等体液中,易于被临床无创性的方法检测出来。所以,肿瘤分泌蛋白质组学研究为肿瘤标志物的开发开辟了一条崭新、充满希望的道路。由于起步较晚,有关肿瘤分泌蛋白质组学的研究目前还为数不多,但取得的成果已经足以证明其是筛选肿瘤标志物的有效方法。迄今为止,与结直肠癌转移相关的分泌蛋白质组学研究尚未有报导。在本研究中,我们利用非标记定量鸟枪法蛋白质组学技术,分析比较了具有相同遗传背景、不同转移潜能的人结直肠癌细胞株SW480和SW620的分泌蛋白质组,并对感兴趣的差异分泌蛋白进行了较为全

5、面的验证,以期发现对结直肠癌转移有预测价值的血清标志物。首先,我们以来自同一亲本的人结直肠癌原发灶细胞株SW480和淋巴结转移.灶细胞株SW620作为体外研究的模型系统,通过条件的反复优化,从这两株细胞的无血清培养上清中成功的收集了高质量的分泌蛋白样本。随后,用特异性的胰酶消化蛋白质,酶解后的肽段经变性、脱盐等处理后经高效液相色谱分离,最后用Finnigan(TM) LTQ(TM)线性离子阱串联质谱进行分析。质谱所采集到的原始数据用SEQUEST程序搜索国际蛋白指数(International Protein Index,IPI)人蛋白非冗余库(Version 3.26)以鉴定蛋白质。利用液相

6、色谱-串联质谱技术,我们从SW480和SW620细胞的分泌蛋白样本中总共鉴定出了910个非冗余蛋白质。由于这些蛋白质的识别均是基于两个及以上独特肽段的,所以更加严格和可靠;据我们所知,这也是迄今为止鉴定蛋白质数目最多的结直肠癌相关研究。为保证后续非标记定量的质量,我们对液相色谱-串联质谱分析结果的重复性和可靠性进行了评估。结果发现:1、共计6次液相色谱-串联质谱分析的二维图谱具有极高的相似度。2、SW480和SW620各3次重复的液相色谱-串联质谱分析中鉴定到的蛋白质数量稳定。3、SW480和SW620的3次实验所识别蛋白的重复性分别为77%和74%。4、在设定的参数下,肽段错误发现率为3.8

7、2%。证明液相色谱-串联质谱分析的稳定性和重复性好,肽段鉴定的可信度较高。在此基础上,利用DeCyder(TM) MS差异分析软件(Version 1.0),对液相色谱串联质谱所得的全扫描前体质谱峰图进行检测、谱图比较和定量。所有的检测、匹配及鉴定都在DeCyder MS的全自动模式下进行,无需手动的指定或更正。最后采用统计学组间t检验方法,得到所有P0.5且排除有信号肽的蛋白即被判定为非经典分泌蛋白。最后,从70个胞内蛋白中成功的预测出了23个(33%)非经典分泌蛋白,证实了我们的推测。我们利用DAVID和KEGG网站的分析工具获取了差异分泌蛋白的的功能聚类和信号通路分类的重要信息。我们发现

8、,这些蛋白的主要生物学功能涉及细胞分化、细胞骨架组构、凋亡、解剖学结构形态发生、细胞增殖、细胞粘附及外部刺激反应等方面;而肌动蛋白细胞骨架调节通路、细胞外基质-受体相互作用通路、局部粘附通路等都存在着蛋白的富集。这些功能和信号通路在肿瘤发生、发展过程中均起着至关重要的作用,提示我们所识别的差异分泌蛋白是与肿瘤发生、发展密切相关的蛋白,有可能包含重要的肿瘤标志物。利用WebGestalt网站提供的组织表达分析工具,我们还识别了25个在结肠高特异性表达的差异分泌蛋白,它们有成为结直肠癌特异性标志物的潜能。从145个差异分泌蛋白中,我们选择了7个(TFF3、GDF15、AGR2、LASP1、TGM2

9、、LCN2和IGFBP7)进行荧光定量PCR分析和Western blot验证。荧光定量PCR分析发现,7个蛋白中,除了LASP1,其余6个的mRNA表达的变化趋势均与质谱定量的结果一致。对细胞培养上清和细胞裂解液中差异分泌蛋白的Western blot检测显示:在培养上清中,7个蛋白的相对表达变化均与质谱定量结果完全一致,这就直接证明了我们质谱分析结果的可靠性。在细胞裂解液中,TFF3、AGR2、GDF15、TGM2和LCN2的相对表达也与质谱定量结果一致,说明这些蛋白分泌增加可能是合成增加的结果。但是,LASP1在细胞裂解液中的表达却呈现出与质谱定量以及上清中检测结果相反的变化,而与前面P

10、CR结果一致。所以,我们推测:LASP1存在合成和分泌不一致的情况。即在mRNA和总蛋白水平上,LASP1在SW620细胞中的表达较SW480细胞下调,但其在SW620细胞中分泌量却显著增加,从而使其在SW620细胞培养上清中表达上调。当然,为何会出现蛋白合成与分泌不一致的现象,在SW620细胞中,LASP1又是通过什么机制而分泌增加的,还不得而知,需要后续的实验研究。此外,我们发现,虽然IGFBP7在SW480细胞的培养上清中有较强的表达,却未能在细胞裂解液中检测到其表达,推测该蛋白可能在合成后即迅速、完全的释放到胞外。这些在结直肠癌原发灶细胞株SW480和转移灶细胞株SW620之间存在差异

11、表达的分泌蛋白可否成为结直肠癌转移相关的血清标志物呢?这是我们最为关注的问题。为此,我们选择了两个在SW620中表达上调的分泌蛋白TFF3和GDF15进行了更深入的研究。首先,我们用免疫组织化学的方法检测了TFF3与GDF15在38例有淋巴结转移的结直肠癌(每例均有原发灶和配对的转移淋巴结)和31例无转移的结直肠癌中的表达情况。结果发现,TFF3和GDF15的阳性染色主要定位于癌细胞的胞浆中。其中,TFF3在淋巴结转移组的表达水平略强于无转移组,差异无统计学意义(P=0.157);但是,淋巴结转移灶中TFF3的免疫组织化学染色明显强于其配对的原发灶(P0.05)。与TFF3不同,GDF15的表

12、达与TNM分期有关,TNM分期/期的结直肠癌GDF15表达水平显著高于/期(P<0.0001)。两个指标联合诊断的ROC曲线分析发现:对于判别诊断结直肠癌,血清TFF3与GDF15联合(曲线下面积:0.926)较TFF3或GDF15单独诊断时效能增强,差异均有显著性(P<0.0001);而对于预测结直肠癌转移,血清TFF3与GDF15联合(曲线下面积:0.866)较TFF3单独诊断的效能增加,但和GDF15之间无显著性差异。我们还对结直肠癌血清TFF3、GDF15水平与临床病理特征的关系进行了分析。结果发现两者均随肿瘤TNM分期进展而增高、在高级别的结直肠癌中高于低级别结直肠癌、有远处转移的患者中高于无远处转移的,差异均有统计学意义(P<0.05)。此外,结直肠癌TFF3、GDF15血清浓度与性别、年龄、肿瘤部位等临床病理参数无统计学相关性。以上结果说明TFF3和GDF15和结直肠癌