蚤休皂苷对氧化损伤脐静脉内皮细胞内钙离子变化的影响

1、蚤休皂苷对氧化损伤脐静脉内皮细胞内钙离子变化的影响         09-08-30 16:39:00     编辑：studa20                    作者：高琳琳，李福荣，康莉，司艳红，王浩 【摘要】  目的利用激光共聚焦显微镜研究蚤休皂

2、苷（Pa）对H2O2诱导的脐静脉内皮细胞（ECV304细胞）损伤的钙离子（Ca2+）的变化及其机制。方法体外培养ECV304细胞，建立氧化损伤的细胞模型，然后分为5个实验处理组：正常对照组；氧化损伤组；高浓度蚤休皂苷（1 g/ml）组 ；中浓度蚤休皂苷（100 pg/ml）组；低浓度蚤休皂苷（10 pg/ml）组；应用激光共聚焦显微镜观察其细胞凋亡的形态学差异。并利用激光共聚焦显微镜观察、图像分析仪分析各实验分组细胞中游离Ca2+的表达、激光共聚焦显微镜描记预处理前后Ca2+的动态表达。结果损伤组细胞内游离Ca2+浓度明显高于正常组(P<0.01)，而各蚤休皂苷预处理组均使Ca2+荧光强

3、度下降，显著低于损伤组(P<0.01)，并呈剂量依赖性效应。H2O2损伤剂量的刺激下，ECV304胞浆内的游离Ca2+呈现双相变化：由静息状态持续增加到峰值，F为37.22±3.72，平台期与静息状态荧光值的变化P为7.65±0.69，加入蚤休皂苷预处理10 min后，再加入100 mol/L的H2O2 ，F和P均明显下降(P<0.01)。结论蚤休皂苷可以保护H2O2造成的ECV304细胞的氧化损伤，与抑制了钙离子介导的凋亡通路有关，达到保护内皮细胞、抗动脉粥样硬化的目的。 【关键词】  蚤休皂苷 内皮细胞 凋亡 钙离子 动脉粥样硬化Abstract：

4、ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of Pariphyllin （Pa）on calcium ion density in injury ecv304 induced by hydrogen peroxide.MethodsECV304 cells were cultured in vitro, the oxidative injury was built by hydrogen peroxide (H2O2）,cells were divided into five experimental groups:1.normal,

5、2.oxidative damage group,3.high density Pariphyllin（1 g/ml）,4.medium density Pariphyllin （100 pg/ml）and 5.low density Pariphyllin（10pg/ml）.Laser confocal microscopy(LCM) was used to observe quiet state and dynamic change of the density of calcium ion (Ca2+).Results The LCM showed that in damaged gro

6、up, the external Ca2+ concentation was the highest,but in pretreated groups,it was decreased in dose dependent manner（P<0.01）.H2O2 elicited an transient peak of Ca2+i and then fell to a subsequent sustained higher plateau.Pretreatment with pariphyllin（1 g/ml）for 10 minute significantly prevented

7、the transient  increase and sustained the increase of Ca2+i.ConclusionPariphyllin has protective action against oxidative damage of ECV304 induced by H2O2, its mechanism may be related to decreasing the cell apoptosis and inhibiting calcium ion-decreased mediated signal transduction .Key words：

8、 Pariphyllin;   HUVEC;   Apoptosis;    Ca2+;  Atherosclerosis    内皮细胞损伤是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)发生的关键环节，目前占主导地位的“损伤-反应假说”和近来许多研究 1证实内皮细胞凋亡在动脉粥样硬化中的作用。H2O2可促进内皮细胞凋亡，而细胞凋亡在AS发生发展中起着重要作用2。有报道发现含蚤休的方剂能够减轻高脂血症大鼠动脉内皮细胞损伤，减少内皮细胞合成和释放内皮素3。具有保护动脉内皮细胞和抑

9、制主动脉中膜平滑肌增殖的功效，从而具有防治动脉粥样硬化和高血压病的作用。但对于蚤休皂苷保护动脉内皮细胞损伤防治动脉粥样硬化发生的作用在国内外尚未见报道。为了进一步探讨中药蚤休对内皮细胞损伤的抑制机制，本实验应用激光共聚焦显微镜观察其凋亡的形态学差异。并利用激光共聚焦显微镜观察分析各实验分组细胞中游离Ca2+的表达；预处理前后细胞内Ca2+的动态表达，旨在进一步探讨蚤休皂苷对细胞损伤保护作用的机制及其之间的相互关系。1  材料与仪器1.1  材料人脐静脉内皮细胞株ECV304购于武汉大学典型培养物保藏中心；蚤休干片（购于济南建联药店），蚤休皂苷（Pariphyllin，Pa）

10、为暗红色粉状结晶，由泰山医学院药物化学教研室提取鉴定，每0.5 kg蚤休干片得到皂苷结晶27 g，纯度为98.79%。用RPMI1640（Gibico公司，美国）培养液稀释至1 000，100，10 pg/ml，微孔滤膜过滤除菌，-20保存备用； 荧光探针Fluo-3/ AM (Molecular Probes Inc产品，美国)溶于DMSO中，配成贮存液，放于-20冰箱保存；HEPES缓冲液(mmol/L )等试剂购于济南联星生物试剂公司。1.2 仪器激光共聚焦显微镜：美国Bio-Rad  Radiance  2100。2 方法2.1 细胞培养及干预将ECV304细胞在3

11、7，5%CO2条件下培养，以含10%FBS的RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/ml，按每瓶2 ml接种于25 ml的细胞培养瓶，每48 h更换培养液1次。待细胞融合率为70%80%时，无血清培养12 h后使细胞同步化于G0期，然后按分组分别加药进行预处理24 h，再加入氧化损伤药物H2O2，终浓度为100 mol/L，作用12 h。细胞分组如下：正常对照组:不加任何药物的培养基；氧化损伤组: H2O2终浓度为100 mol/L；蚤休皂苷高、中、低剂量预处理组: （1 g/ml，100 pg/ml，10 pg/ml），调整各组细胞浓度为5×105×1

12、06个/ ml。2.2 激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内游离Ca2+荧光强度的含量 将ECV304制成105个/ml的细胞悬液接种于35 mm Petri细胞培养皿中，实验分组加药同上， 孵育24 h后用HEPES缓冲液洗涤两遍，加入终浓度为10 mol/L的Fluo-3/AM 37负载。40 min后再用HEPES缓冲液洗涤2次，立即置于激光扫描共聚焦显微镜下观察，激发波长为488 nm，发射波长为525 nm。实验中选用512线光束扫描成像，图像分辨率为512×512像素，采集频率0.20.5 Hz。使用Simple PCI软件收集Ca2+图像、分析Ca2+的改变。每个处理组选取大约30个细胞，记录平均荧光强度，以此来衡量ECV304内游离Ca2+的水平。2.3 激光共聚焦显微镜观察各处理组细胞内游离Ca2+的动态变化 按以上所述负载ECV304，设定激光共聚焦显微镜激发波长为488 nm，扫描方式为时间扫描，时间间隔为每5 s一个循环，连续扫描600个循环。首先观测静息状态下细胞内Ca2+水平，然后预先加入终浓度为1 g/ml的蚤休皂苷，10 min 后加入H2O2 ，终浓度为100 mol/L；动态观测细胞内Ca2+