水稻抗性转基因研究进展

1、5生物工程进展62001,Vol.21,No.2水稻抗性转基因研究进展张祥喜1华志华2陈光宇1黄大年2(11江西省农业科学院生物工程中心,江西南昌330200;21中国水稻研究所生物工程系,浙江杭州310006摘要随着水稻遗传转化技术的发展,通过基因工程手段获得抗病虫草害及逆境水稻品种成为可能。本文综述了近年来国内外水稻抗性转基因的技术、方法和策略等研究现状、发展趋势、存在的问题及解决方法,对水稻抗性转基因在水稻育种上的应用也作了评价。关键词转基因抗性水稻水稻(O ryza sativa L.是世界上最重要的禾谷类作物之一,包括大多数发展中国家在内约占总数40%的人口,其主要营养来源于水稻13

2、。但在水稻生产中,由于稻瘟病、纹枯病、白叶枯病,各种线虫、病毒病,以及螟虫、飞虱、叶蝉等病虫草的为害和不良气候与环境(逆境的影响,严重制约了水稻的高产、稳产,从而直接威胁到人类的生存与发展39。实践证明,培育和利用抗性品种是解决上述问题最经济有效的方法。但由于品种选育周期较长,抗性亲本缺乏等原因,通过常规育种手段获得抗性品种相当困难。80年代以来,由于生物工程技术的兴起和发展,特别是基因工程技术在改良作物抗性上的广泛应用,为培育抗性品种提供了新的手段,从而开辟了水稻抗性育种的新时代1,10。自1986年Powell Abel 等人首次获得转CP基因抗T M V烟草植株以后,第一批水稻转基因植株

3、亦在1988年问世1112。水稻的抗性转基因研究在过去的十几年中取得了重大的进展,某些抗性材料已完成生物安全性评价,进入了田间释放和大田应用阶段,正向实用化发展13。到目前为止,已报道成功地获得抗性转基因水稻植株的国家有中国、美国、菲律宾、英国、日本、印度等,其转化技术日趋成熟、转化频率逐步提高,展示出巨大的应用潜能和美好的前景。植物抗性转基因一直是生物工程技术人员的研究重点。高效稳定的水稻转化系统的建立为外源基因转入水稻创造了条件5。转基因技术将水稻基因库中不具有的抗性基因导入水稻,实现了传统育种方法无法实现的基因重组,大大提高了育种水平12。国内外科学家对水稻抗性转基因作了大量研究。目前,

4、水稻抗性基因的转化方法以基因枪法为主,农杆菌介导法、PEG法、电击法次之;许多重要的抗病、抗虫、抗除草剂、抗环境胁迫等基因已从植物或其他生物中分离,应用最多的抗性外源基因是bar基因、Bt毒蛋白基因、X a基因(包括X a4、Xa7、X a10、Xa21和G NA基因,其他如CpTI、C P、O C2 1$D86、Chitin、Pin2、Cecroption B、BA D H、HV A1基因应用较少(表1。1抗病转基因在现有文献报道中,研究者通过基因枪法、PEG 法、电击法、花粉管通道法以及胚浸泡等方法将抗病基因导入水稻基因组,获得抗稻瘟病、白叶枯病、细菌性条斑病、线虫病以及病毒病等转基因水稻

5、当代植株,有的研究还对抗病基因的遗传与表达作了系统的分析。稻瘟病是水稻重要病害之一,各国科学家一直致力于抗稻瘟病基因的标记、定位和克隆。最近,日本科学家Wang等13基于图位克隆策略,成功地分离出一个对日本大多数稻瘟病菌生理小种具有高抗表现的Pib基因,分析了其结构和标记片段;同时用PEG法转化感病品种Nipponbare,得到496株转基因水稻植株,其中有112株对生理小种003表现抗性,进一步的分子分析表明获得/c230的转化事件具有对稻瘟病的抗性;2个T2代株系的抗感分离比表现为3B1。作者没有对转基因植株作进一步的田间试验,但抗稻瘟病基因的克隆无疑对今后抗稻瘟病基因的遗传转化和品种选育

6、具有划时代的意义。Lin等6用PEG法将CaM V35S启动子驱动的几丁质酶基因(CHI11转入籼稻品种Chinsurah Boro15的原生质体,获得了28株可育植株,Southern及生物测定结果表明,外源基因已整合并表达对水稻纹枯病的抗性;T1代分离比例大部分符合3B1分离规律。表1水稻抗性转基因研究中的主要外源基因基因名称作用应用文献Xa21抗白叶枯病基因抗水稻白叶枯病7,18 Cecropin B抗菌肽B基因抗水稻白叶枯病、细条病15,16C HI11几丁质酶基因抗水稻纹枯病等6Pib抗稻瘟病基因抗水稻稻瘟病13OC2I$D86半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因抗线虫8C P外壳蛋白基因抗病毒

7、病19,20,21Pi n2马铃薯蛋白酶抑制剂基因抗虫5C pTI豇豆胰蛋白酶抑制基因抗虫27cryIA(bB t毒蛋白基因抗鳞翅目昆虫2,4,9,22,24G NA雪花莲凝集素抗虫26,27bar抗草丁磷基因抗PPT类除草剂,外源基因、选择标记基因2,3,5,15,16,25,26, 28,29,31,32,33,34, 39,42BAD H甜菜碱醛脱氢酶基因耐盐38 HVA1胚胎发生后期丰富蛋白基因耐旱39,40目前在抗水稻细菌性病害转基因研究方面比较成功的是抗菌肽基因、Xa21基因的遗传转化,转基因水稻对白叶枯病、细菌性条斑病的抗性明显提高。黄大年1415、简玉瑜等16用基因枪法将Cec

8、ropin B 基因导入粳稻和籼稻品种,获得了抗白叶枯病和细条病水平显著提高的转基因植株。华志华等17对转CecropinB基因水稻T0T5代共6个世代的不同株系进行抗白叶枯病分析,结果表明转基因水稻对白叶枯病的抗性在后代中得到遗传,抗病性能传至高世代(T4代,单株之间抗病性存在较大差异,并认为其原因可能与Cecropin B基因的分离、丢失或基因沉默有关。Tu等7通过基因枪法将Xa21基因导入IR72,获得抗白叶枯病的转基因植株,T1代获得抗性基因遗传并出现3B1的分离规律;进一步用病菌小种4和小种6接种鉴定,结果表明T1代阳性植株抗白叶枯病。严成其等18通过花粉管通道法将含X a21广谱抗

9、白叶枯病的1188(美国品种外源D NA转入到1067等7个品种中,经检测部分供体D NA已整合到受体品种(系中。陈善葆等11也用花粉管通道法将水稻白叶枯病抗性供体品种早生爱国3号的D N A导入高感受体水稻品种856403中,得到了高抗白叶枯病的植株,并且能遗传至24代。Vin等8用基因枪法将半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因(OC2I$D86转入非洲重要的水稻品种I TA212等,获得对线虫病的抗性。结果表明,所有品种的转化频率都达到8%以上,部分转化株系分析表明,植株根部半胱氨酸蛋白的表达水平达到012%。转基因植株可使线虫的产卵量减少55%,这为M e loid2 o gyin inco gni

10、ta及其他线虫病害的防治提供了一条新途径。病毒外壳蛋白抗病毒病转基因水稻的成功例子有:1991年日本获得水稻品种Kinuhikari Nipponbai 转RSV的CP基因工程植株,接种实验结果表明,转基因植株在23周后,只有3%5%的发病率,而对照植株的发病率为9515%100%10。K ouassi 等19用基因枪法将RY M V的CP基因转入粳稻品种台北309的胚性愈伤组织中,获得了对RY M V的抗性株系。Hayakaw a等20用电击法将水稻条纹tenui 病毒的CP基因转入两个粳稻品种绢光、日本睛,R0及其自交后代均表现出高含量的C P蛋白及对病毒病传染的抗性。Z heng等21将

11、RD V外壳蛋白基因S8转入粳稻中华8号等,获得转基因植株,Southern 和Western印迹分析证实,RD V S8基因已整合到水稻基因组,并在水稻中得到表达。2抗虫转基因利用生物工程技术将外源抗虫基因导入水稻,使水稻自身产生抗虫蛋白而达到抗虫目的成为可能。国内外科技人员将外源基因如B t毒蛋白基因cryI A(b、豇豆胰蛋白酶抑制基因CpTI、雪花莲凝集素G N A等转入水稻,增强其对害虫的抵抗力,取得了巨大的进展,有的已进入了田间试验阶段。目前,16应用最广泛的抗虫基因是苏云金杆菌(Bac illus thuringiensisBt毒蛋白基因。它的表达产物与昆虫肠道上皮纹缘细胞上的受

12、体位点结合,引起并破坏纹缘膜细胞渗透压的平衡,使细胞裂解,对昆虫产生特异杀伤作用10。其中用到的基因转化方法主要是基因枪法和农杆菌介导法。舒庆尧等22用农杆菌介导法将密码子经优化的cryIA(b基因导入秀水11,获得高抗二化螟、稻纵卷叶螟的转c ryIA(b基因品系TS5、T S9等(命名为克螟稻,并检测出其Bt毒蛋白的含量占可溶性蛋白的015%3%,对15龄幼虫的毒杀作用达到100%;谢道昕等23采用花粉管通道法成功地将Bt 基因导入水稻品种中花11号,获得了转基因水稻植株,分子杂交技术证明杀虫基因已整合到水稻基因组中。Datta等4研究了启动子对抗虫蛋白基因cryIA (b的遗传和表达的影

13、响。将分别由CaM V35S和Actin21启动子,以及两种组织特异型启动子(pith, PEPC构成的启动子驱动的cryIA(b基因,用基因枪法转入12个水稻品种的原生质体,得到1800株转Bt基因水稻植株。Southe rn分析显示至少100株独立转化的植株中整合有cryI A(b基因。由PEPC启动子驱动的转化植株,CryI A(b蛋白在绿色组织(如叶和茎中高效表达,首次报导了避免组成型启动子导致抗虫蛋白在水稻种子和其它组织中的不必要表达的策略。对超过800株Southern阳性植株进行了生物测定,结果81株转基因植株对三化螟幼虫的致死率为100%。此外,世界各地还有许多实验室开展了Bt

14、抗虫蛋白转基因研究工作。Wu等9利用基因枪法将Actin21启动子驱动的cryI(b基因导入粳稻台北309的愈伤组织,获得了可育的转基因植株,对三化螟的抗性明显增强。Joachim等2也用基因枪法将cryIA (b基因转入籼稻品种IR58,R0、R1、R2代植株对几种鳞翅目昆虫具有明显的杀虫效果,对三化螟、二化螟的杀虫效果达到100%,对稻纵卷叶螟、M arasmia suppressalis也有抑制取食作用。Alam等24用基因枪法将cryIA(b基因导入籼稻品种Vaidehi中,转基因的遗传在T1代植株中得到证实;抗虫性测定结果,转基因植株对三化螟的抗性也增强了。除B t抗虫蛋白转基因研究

15、外,研究者还开展了马铃薯蛋白酶抑制剂基因(pin2、雪花莲凝集素基因(G N A、大豆胰蛋白酶抑制基因(C TI、豇豆胰蛋白酶抑制基因(CPTI,以及玉米胱蛋白基因(corn cystain等转基因抗虫水稻的研究,以期获得稳定遗传和表达的高抗抗虫水稻5,2527。3抗除草剂转基因抗除草剂基因工程是生物技术的一个重要领域。抗除草剂基因在植物遗传转化中经常作为标记基因使用,因此是植物基因工程上涉及最多的领域之一,所取得的成效也最明显。bar是水稻抗除草剂转基因研究中应用最多的一个基因。1992年Cao等人获得了对除草剂Batsta 具有抗性的转基因水稻植株28。中国水稻研究所朱冰等29等利用基因枪

16、法将bar基因导入京引119和中百4号的幼胚,获得了可育的抗Basta的水稻植株,T0代转基因植株表达了对Basta的抗性,后代抗感分离比例不符合孟德尔遗传分离规律,推断bar 基因有可能是双拷贝并处于非紧密连锁状态。经过多年培育,现已成功获得抗Basta转基因水稻稳定品系,并配置了多个抗除草剂转基因杂交水稻组合,近年获准在浙江、四川、江西等省较大面积释放。Sun 等30继黄大年、朱冰等的工作之后,将抗Basta的京引119转基因当代植株用花药培养获得转基因纯系,加快转基因植株稳定株系的获得。用类似的方法,许新萍等31、邓小梅等32的研究丰富并发展了bar基因的遗传转化。Oard等3用基因枪法

17、将bar基因与抗潮霉素基因hpt共转化遗传背景不同的Gulfmont、IR72、Koshi2 hihari水稻品种,获得抗除草剂Basta的转基因水稻。S outhern及Northern印迹分析表明,外源基因已整合并稳定表达。同时还发现bar基因在转录水平上有沉默现象。田间实验结果表明转基因株系是正常可育的,但有近一半的转基因植株在穗期、株高、产量与亲本有显著差异。一般情况下,G ulf mont转基因株系对除草剂抗性比Koshihihari的强,这就意味遗传背景对bar基因的表达具有重要作用。Rathore等33利用bar作为选择标记基因转化原生质体,也获得了抗Basta的转基因植株,T0

18、代自交可育,并且认为bar既是一个有用的选择标记基因,又能表现对除草剂的抗性。T oki等34的研究也取得了类似的结果。有意思的是,Tada等35、Uchimiya等36将转bar 基因水稻用Basta处理,结果发现Basta可以防止白叶枯病及稻瘟病病菌的侵染,因而能减轻两病的发病症状,这为杂草防除和病害防治相结合创造了一条新思路。17此外,Li等37利用抗磺酰脲(sulfonylureaALS 基因(csr121作为一种新的选择标记,获得了可育的抗磺酰脲类除草剂转基因水稻植株。4抗逆转基因逆境是限制植物生长、影响产量形成的重要因素之一。抗逆基因的分离、克隆、转化一直受到科学家们的高度重视。目

19、前已分离出大量的抗逆相关基因,并在抗逆基因的遗传转化中取得了明显的成绩。郭岩等38用基因枪法将来源于含盐生植物菠菜BAD H基因导入水稻品种中花8号等,提高其耐盐性。在温室015%NaCl盐池中移栽的99株转基因植株,19株结实,而对照受盐害现象明显,几乎全部枯萎。Xu等39将来源于大麦的胚胎发生后期丰富蛋白基因(L ea,HA V1,用基因枪法导入水稻悬浮细胞系,获得了大量的转基因植株,HAV1基因在水稻Actin21启动子的驱动下在水稻根和叶片细胞中大量表达;第二代转基因植株表现出明显抵抗干旱和盐渍的能力,并据此认为可以通过使转基因植株积累Lea来提高非盐生植物的抗盐性。Q u等40也获得

20、了类似的研究结果。Yokoi等41用农杆菌介导法将来源于拟南芥的丙三醇232磷酸2脂酰基转移酶基因(G PA T的cD NA 转入水稻中,转基因植株叶片中的不饱和脂肪酸含量比对照高出28%,光合作用效果比野生型高20%,据此研究认为导入拟南芥属GP AT的cD N A可以大大提高不饱和脂肪酸的含量,并赋予水稻光合作用的耐寒性。Su等42等用基因枪法将HVA22基因转入水稻品种Kenf ong中,获得了能稳定表达脱水压力调节的转基因水稻植株。5水稻抗性转基因研究中存在的问题与对策对于保护生态平衡、食物链的稳定及减少环境污染,赋予农作物以自身的抗性是最理想的防治病虫草害及逆境的策略。转基因水稻虽然

21、对病虫草害及逆境可产生很大的抗性,但一个潜在的问题是抗性的持久性,因而保持转基因植株的抗性稳定性就显得非常重要。对解决这一问题,国内外的相关对策有:(1在同一植物中转入多个抗性基因,如可以考虑将豇豆胰蛋白酶抑制基因(CpTI和慈姑蛋白酶抑制基因(API导入水稻,培育多种单基因抗虫品种或多基因抗虫品种;(2利用特异性的启动子、内含子片段,增强目的基因的表达水平;(3合理种植利用转基因抗性水稻,以解决转基因水稻抗虫持久性问题。在转化技术方面,还存在基因转化频率相对较低、实验成本较高、基因型依赖性强、容易发生基因沉默现象等问题,限制了这一技术的广泛开展。目前的转化技术所导入的外源基因拷贝数往往较多,

22、在后代中容易丢失,对片断较大的外源基因难以导入,更未达到外源基因定性、定量、定位转入的水平;基因沉默在转基因植物中是一个很普遍的现象,给植物基因工程产物的商品化、产业化带来了潜在的威胁14。因此抗性基因工程的研究还有待进一步深入。转基因水稻的安全性,一直是各国政府及研究人员十分重视的问题。要警惕水稻抗除草剂基因漂移到红稻等杂草中去。此外,目前尚未见有针对水稻稻瘟病、纹枯病、粘虫等病虫害特异性基因的报道,应加强主要病虫害抗性基因的基础研究。尽管目前的水稻转基因研究存在上述诸多困难与问题,但近几年转基因水稻已在生产中逐渐显示其应有的威力。相信在21世纪初期水稻抗性转基因会在生产中发挥重要作用。参考

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