祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP含量的

1、    祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP含量的影响(1)    】  目的观察祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP（羟脯氨酸）含量的影响。方法大鼠气管内注入博莱霉素建立肺纤维化模型。随机分为正常对照组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组和强的松组。造模次日每天按剂量给药，分别在第7、28天分批次处死动物，制作病理标本，观察肺组织病理形态学变化及计算肺组织HYP含量。结果模型组7d时肺泡腔内大量炎性细胞浸润，可见少量成纤维细胞，I型细胞受损，II型细胞明显增生；28d

2、时肺泡炎减轻，肺间质和胸膜层胶原纤维明显增多。各治疗组7d时炎性细胞浸润较模型组少，肺组织结构较模型组完整，28d时肺泡间隔增厚及间质内成纤维细胞增殖较模型组减轻，电镜下观察亦如此。28d时各治疗组的肺组织HYP含量均低于模型组（P<0.01或P<0.05）。结论除痰散瘀软坚中药能有效抑制博莱霉素引起的肺纤维化形成。 【关键词】  肺纤维化 羟脯氨酸 祛痰 散瘀 软坚肺纤维化是一种以两肺间质纤维化伴蜂窝状改变为特征的疾病。近年来中药防治肺纤维化的研究成为肺科学界关注的焦点，以期寻找更安全、有效的药物治疗本病。本研究采用博莱霉素A5(BLMA5)建立大鼠肺纤维化模型，观察祛

3、痰、散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠病理形态学和肺组织羟脯氨酸(HYP)含量的影响，探讨其对肺纤维化的治疗作用。1  材料与方法1.1  动物、药品及主试剂  SD大鼠80只，体重，由浙江中医药大学动物实验中心提供。批号：ScxK（沪）20040003。复方中药由苏木12g，皂角刺9g，鬼见羽15g等组成，按比例常规水煎，60%醇沉后浓缩为含生药1.82g/ml。所用中药购于浙江省中医院中药房，由中药制剂室制备。博莱霉素A5由天津太和制药有限公司生产，批号 040310。强的松（泼尼松）片剂由浙江仙居制药厂生产，批号040406。对二氨基苯甲酸由天津化学试剂研究所提供，

4、批号020801。 L羟脯氨酸标准品由中国科学院上海生物化学厂提供，批号011207。1.2  动物造模  80只健康SD大鼠，随机选取16只为正常对照组（组），余64只为模型动物，参照文献方法2将所有大鼠用硫喷妥钠（剂量为3mg/100g体重）腹腔麻醉后，仰卧位固定于手术台上，暴露喉头，额镜直视下趁动物吸气瞬间，将与注射器相连的7号钝头腰穿针插入气管内，模型动物注入BLMA5（剂量为2ml/kg体重），并注入0.2ml空气，完毕后迅速将动物直立、顺时针旋转，动物清醒后随意进食。1.3  分组与给药  造模结束后，随机将64只模型动物分为模型组、中药高剂

5、量组（组）、中药低剂量组、强的松组，每组各16只。正常对照组与模型组每天灌服无菌生理盐水1ml/100g体重，1日2次；强的松组每天给予强的松0.6mg/100g体重灌胃（使用时将强的松片剂碾碎，加2ml无菌生理盐水稀释），1日1次，顿服；中药高剂量组每天给予中药1.1ml/100g体重灌胃，1日2次；低剂量组每天给予中药0.55ml/100g体重灌胃，灌胃时加适量生理盐水，稀释至与高剂量组相同的灌胃量，1日2次；以上均喂服28d。1.4  标本采集  分别于第7、28天放血，分批处死动物（每批每组8只）后，迅速开胸，取出心肺，制作病理标本和进行生化检查。分离出肺，夹闭右主

6、支气管，10%福尔马林溶液经左支气管灌注固定30min后，投入10%福尔马林溶液中固定24h，石蜡包埋，常规切片，分别行HE及Masson染色，观察肺泡炎及肺纤维化程序。迅速从右肺切1mm×1mm×1mm组织两块，以冷却2.5%戊二醛进行固定8h后，PBS（PH7.4、0.2mol/L磷酸缓冲液）冲洗，钌红水固定24h，常规切片，进行电镜观察。1.5  形态学分级  根据Szapiel3等方法确定肺泡炎及肺纤维化的程度。利用HE染色的病理切片将肺泡炎分为4级：0级：无肺泡炎（）；1级：轻度肺泡炎（ ），肺泡膈因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺的20%以下

7、；2级：中度肺泡炎（ ），病变范围占全肺的20%50%；3级：重度肺泡炎（ ），呈弥漫性分布，病变范围大于50%。利用Masson染色的切片将肺间质纤维化分为4级：0级：无间质纤维化（）；1级：轻度间质纤维化（ ），病变范围局限在全肺的20%以下；2级；中度肺间质纤维化（ ），病变范围占全肺的20%50%，肺泡结构紊乱；3级：重度肺间质纤维化（ ），病变范围大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。1.6  HYP含量测定  余右肺，称重后剪碎，每克肺组织加无菌生理盐水4ml研磨，以3000r/min离心10min，过滤，得上清液，采用酸水解法测定41.7  统计方法

8、  计量资料以x±s表示，应用SPSS13.0统计软件分析，多组间均数比较采用方差分析，计数资料采用卡方分析。2  结果2.1  肺组织形态学改变          营生网-关注您的营生        【摘】 目的观察祛痰散瘀软坚中药对肺纤维化大鼠肺组织病理形态学及HYP（羟脯氨酸）含量的影响。方法大鼠气管内注入博莱霉素建立肺纤维化模型。随机分为正常对照组、模型组、中药高剂量组、中药低剂

9、 .         本篇论文由网友投稿，3COME文档只给大家提供一个交流平台，请大家参考，如有版权问题请联系我们尽快处理。（各组电镜照片见下图16）图1  正常组肺组织×6200（略）图2  模型组7d×12500（略）图3  模型组28d×12500（略）图4  中药高剂量组28d×12500（略）图5  中药低剂量组28d×12500（略）图6  强的松组28d×12500（略）2.2&#

10、160; 肺组织HYP含量的变化  造模后7d，模型组和各治疗组的羟脯氨酸含量与正常对照组相比无差异，各组羟脯氨酸含量比较无差异；造模28d，模型组羟脯氨酸含量明显高于正常对照组（P<0.01），中药高剂量组和强的松组羟脯氨酸含量明显低于模型组（P<0.01），与正常对照组比较无差异；中药低剂量组羟脯氨酸含量虽高于正常组但仍低于模型组，各治疗组间无明显差异。各组含量见表1。表1  各组大鼠肺组织羟脯氨酸含量测定（略）与正常组相比，*P<0.05；*P<0.01；与模型组相比,#P<0.05；#P<0.013  讨论 &

11、#160;   本病为痰、瘀互结，气血失调，正气虚弱，五脏阴阳失衡的重疑之病，呈痰浊、瘀血及气与阴津相合致病，连锁推进的错综交互、缠绵难愈的病理效应，尤以瘀血痰浊、痰瘀交阻的内伤实邪更为突出。所以临诊多以除痰行气、散瘀软坚之品治疗本病。本研究选取除痰散瘀软坚之苏木、皂角刺、鬼见羽组成中药复方，其中苏木味甘、咸，性凉，有入血行血，辛咸消散，亦兼有软坚润下之功，能祛一切凝滞留结之血5；鬼箭羽，味苦，性辛寒，归肝肺经，有清热解毒、活血祛瘀、软坚消痈的作用5；皂角刺，辛温，归肺、肝经，有化痰、透脓、活血消肿的功效，是搜痰药，能祛聚于胸膈之上的胶固稠浊之痰5。三药合用，共奏清热祛痰、

12、活血化瘀生新之效。     肺间质纤维化病理过程可分为早期的肺泡炎阶段和肺间质纤维化的形成阶段。肺纤维化以大量的成纤维细胞聚集、细胞外基质沉积、胶原形成并伴有炎症和损伤所致组织结构破坏为特征6。胶原蛋白的合成与沉积是肺纤维化的基础，胶原的含量可反映肺纤维化的程度。羟脯氨酸（HYP）是胶原蛋白的重组成部分，是胶原特有的氨基酸，通过测定羟脯氨酸的含量可反映细胞合成和分泌胶原蛋白的功能，因此作为肺纤维化的指标，可以判断肺纤维化的程度78对肺纤维化的进展有重意义。本实验结果表明，造模7d后，模型组大鼠肺组织切片可见肺泡腔内渗出物增多，肺泡腔及肺间质有大量炎性细胞

13、浸润。可见少量成纤维细胞，局部肺萎陷，部分肺泡结构破坏；到28d时，肺泡炎减轻，肺泡壁显著增厚，一部分肺泡腔消失，由胶原纤维、成纤维细胞占据，肺间质和胸膜层胶原纤维显著增多，小血管壁增厚明显；电镜观察亦如此，此病理改变符合肺纤维化的病理形态变化，而正常对照组肺组织结构正常无类似改变，说明本实验复制肺纤维化模型是成功的，是符合实验求的。而中药高剂量组、低剂量组7d时肺间质炎性细胞渗出和炎性细胞浸润均较模型组少，肺组织结构较模型组完整，28d时肺泡间隔增厚及间质内成纤维细胞增殖亦较模型组减轻，和强的松组7d、28d时肺脏组织学病理改变相近。造模7d后，各组肺羟脯氨酸含量无明显变化，这也符合肺纤维化

14、早期以肺泡炎为主的病理变化，而造模28d后，模型组肺羟脯氨酸含量显著升高，高于正常对照组（P<0.05），经中药或泼尼松治疗后，肺羟脯氨酸含量明显下降，与同期模型组比较有显著差异，中医治疗组作用与强的松组相仿，各治疗组间无显著差异。表明此祛痰散瘀软坚中药能有效改善肺纤维化大鼠肺组织病理，显著降低肺组织中羟脯氨酸含量，有抗肺纤维化的作用，与西药强的松相当。这一实验将为祛痰散瘀软坚中药的临床推广运用和进一步探索其对肺纤维化的防治作用和作用机制提供实验依据。【参考文献】  1 陈灏珠.实用内科学M.第12版.北京，人民卫生出版社，2005：17301732.2 褚宏伟.纤维连接蛋白和

15、层粘连蛋白在大鼠肺间质纤维化中的变化J.中华医学杂志，1991，71（2）：87.3 Szapiel SV，Elson NA，Fulmer JD, et al. Bleomycininduced interstitial pulmonary disease in the nude, athymic mouseJ. Am Rev Respir Dis,1979,120:893899.4 杨陟华J.大鼠肺羟脯氨酸的测定方法及应用J.军事医学科学院院刊,1995,19(1):4446.5 南京中医药大学编著.中药大辞典M.上海：上海科学技术出版社，2006：23692371.6 孔琪.肺纤维化的发病机制及关键靶点J.国外医学呼吸系统分册，2005，25（5）：331333.7 Russell PB, James DC. Oxidative stress in airways: Is there a ro