高效液相色谱及其联用技术在汞形态分析中的应用

1、第18卷第4期分析科学学报2002年8月V o l . 18N o . 4JOU RNAL O F ANAL YT I CAL SC IEN CE A ug . 2002文章编号:100626144(2001 0420338206高效液相色谱及其联用技术在汞形态分析中的应用梁立娜江桂斌(中国科学院生态环境研究中心, 北京, 100085摘要:本文对近二十年来高效液相色谱及其联用技术在汞的形态分析中的应用进行了综述。着重讨论了样品的前处理方法, 高效液相色谱用于汞化合物的形态分离以及检测器的选择。关键词:高效液相色谱; 汞; 形态分析; 联用技术中图分类号:O 657. 7+2; O 655.

2、6文献标识码:A汞是对人类和高等生物最具危害的元素之一, 有机汞化合物在农业中常用作杀虫剂和杀菌剂, 无机汞通过生物甲基化作用生成毒性更强的甲基汞, 从而被动植物吸收, 并通过食物链的富集作用进入人体, 其富集倍数可高达1061071。发生在日本的水俣湾事件就是由于人食用了被汞严重污染的海产品而引起的。进入人体的氯化甲基汞70%能被人体吸收2, 其在人体内的半衰期为75天3。汞化合物在人体内主要集中在中枢神经系统、肾和肝脏中, 而98%的甲基汞留在脑中4。人体血液中甲基汞的含量超过0. 2g g 时就会出现中毒症状5。汞化合物的毒性依赖于其浓度及其不同的化学形态。烷基汞的毒性比芳基汞和无机汞都

3、大。鉴于不同形态的汞化合物其毒性差别很大, 故采用高灵敏度的形态分析方法测定环境样品和生物样品中汞的含量是非常必要的。近几年来, 色谱和各种检测器的联用技术在汞的形态分析中得到了越来越广泛的应用。W est 6首先用气相色谱(GC 和电化学检测器(ECD 联用测定了鱼中甲基汞的含量。高效液相色谱(H PL C 与气相色谱相比, 具有以下优点:(1 汞化合物的分离在室温下和在水溶液中进行, 避免了气相色谱方法中化合物的分解所引起的测定的不准确性和溶剂的挥发对人体的毒害作用。(2 可分离低挥发性或非挥发性的汞化合物, 如汞撒利酸或芳香族有机汞化合物, 这在气相色谱中是一大难题。目前高效液相色谱与多

4、种检测器联用可测定环境样品和生物样品中的汞化合物。紫外检测器是一种广泛使用的检测器, 但其灵敏度和选择性较低; 元素特效检测器如原子吸收、原子荧光、原子发射和等离子体的选择性和灵敏度都很高, 可以满足不同程度的测定要求。1样品前处理利用高效液相色谱可进行多种环境样品和生物样品的分析。常用于汞化合物的萃取方法有四种:水蒸气蒸馏技术、酸浸提、碱消解和超临界流体萃取。这四种方法分别适用于不同的样品, 现简介如下:1. 1水蒸气蒸馏技术水蒸气蒸馏技术用来萃取环境样品和生物样品中的甲基汞化合物是近几年刚刚发展起来的一种新型技术, 可克服复杂的基体效应。硫酸和氯化钠的加入使水蒸气蒸馏法的回收率和重复性高达

5、95±5%7。Falter , Ilgen 和Sch ler 研究小组应用水蒸气蒸馏技术22, 36, 44萃取了土壤、底泥和生物样品中的甲基汞。称0. 051. 0g 样品于蒸馏烧瓶中, 加入9. 5mL 水, 0. 2mL 20%氯化钾或氯化钠, 0. 3mL收稿日期:2000212229通讯联系人:江桂斌基金项目:国家自然科学基金(N o . 29825114 833饱和防泡剂, 蒸馏开始前加入0. 5mL 8m o l L 硫酸, 以140或180的恒定温度在铝制容器中加热蒸馏, 通入氮气。使馏出液以68mL h 的速度流出, 收集在10mL 玻璃烧瓶中, 用冰水浴冷却。向馏

6、出液中加入0. 3mL 吡咯烷二硫代氨基甲酸钠(SPDC , 用二蒸水稀释至10mL , 注入富集柱, 分离检测。在蒸馏过程中, H g 2+与C l -形成H gC l 42-, 保留在蒸馏烧瓶中, N 2通入后, 相当部分的H gC l 42-在热的蒸馏烧瓶中分解生成挥发性的H gC l 2, 被吹至馏出液中。若使用非特效元素检测器, 馏出液中大量的无机汞离子的存在会干扰甲基汞的测定, 故应事先将其用阴离子交换法除去7。此方法对甲基汞的回收率很高, 而其它有机汞化合物的回收率很低, 宜使用其它萃取方法。1. 2酸浸提土壤10和底泥14中富含矿物质、硫化物、氨基酸和蛋白质等, 这些物质中所含

7、的巯基与汞化合物的结合非常牢固, 必须加入氢卤酸(盐酸和氢溴酸 或有机酸(柠檬酸、抗坏血酸、草酸和半胱氨酸 和络合剂23将汞化合物从土壤和底泥中释放出来, 形成烷基汞卤化物, 从而能溶解在甲苯或氯仿等有机溶剂中。H em p el 10等人比较了几种从土壤中有效萃取各种汞化合物的方法, 盐酸、碘化钾2抗坏血酸和草酸萃取甲基汞的效率分别可达80%、78%和83%; 萃取乙基汞的效率分别可达86%、32%和83%。半胱氨酸仅能部分(<36% 地将甲基汞从土壤中萃取出来, 而对乙基汞的萃取率为0。汞化合物被萃取至甲苯或氯仿后, 将有机相转移入样品管中, 或者直接缓慢吹入氮气13或空气45, 将

8、有机溶剂吹干后用流动相稀释进样可提高灵敏度; 或者用硫代硫酸钠(用醋酸铵调节酸度 14,23, 25, 41或半胱氨酸15反萃取后直接进样, 若必要可向硫代硫酸钠溶液中吹入氮气或空气23,41使其蒸干, 而后将有机汞溶解在水中23。利用酸浸提的方法萃取生物样品(鱼类25,41, 45、海豚肝脏33、头发35、人尿和西红柿13、贻贝和鸟蛤15 中的有机汞化合物也得到了广泛的应用。一般需要在酸浸提之前加入丙酮除去样品表面的脂肪15, 35, 45, 在此过程中汞的损失率低于4%35。Ho lak 41采用硅藻土为载体, 将酸浸提所得汞化合物附着在硅藻土上, 填装到色谱柱中, 用氯仿淋洗, 然后用硫

9、代硫酸钠反萃取, 萃取率可高达98. 3%。L angseth13在甲苯和氯仿混合溶剂中加入双硫腙, 可提高汞化合物从盐酸向有机溶剂中的萃取效率。Falter 35则直接用流动相(含SPDC 作络合剂 作萃取剂, 通过两直接相连的注射器反复萃取, 萃取2h 后直接取一定量进样。酸浸提的局限性在于甲基汞不能定量的从基体中分离出来, 盐酸萃取率只有84%, 仍有16%保留在底泥中, 或者已分解, 或者键合能力太强, 不能被有效萃取出来。有13%的汞不能被萃取至甲苯中, 甲苯萃取过程中的损失可归因于甲基汞的分解。在旋转蒸发过程中, 甲基汞的挥发性会导致其损失。萃取过程中的总损失率达50%14。加入C

10、uSO 4和HB r 可提高甲基汞的释放量, 但仍不能定量释放7。另一方面在甲苯或氯仿萃取过程中容易产生泡沫, 通过放置泡沫可消失, 得到两相的完全分层, 但反萃取至半胱氨酸时发现甲基汞的回收率极低15。1. 3碱消解对于生物样品来说, 碱消解是一种非常有效的萃取方法, 萃取效率可达95%105%8。常用的碱消解试剂为四甲基氢氧化铵(TM A H 或25%氢氧化钾 甲醇溶液。在超声水浴中萃取可将萃取时间由124h 缩短至12h 38。待碱消解液冷却后, 加入6m o l L 盐酸酸化, 然后加入双硫腙萃取, 用硫代硫酸盐溶液再次反萃取, 可有效减少基体干扰效应24。由于底泥中大量有机物质的存在

11、, 用酸2有机溶剂萃取会发生严重的乳化现象, 产生大量的泡沫, 增加了萃取时间, Hovert 7等人用25%氢氧化钾 甲醇溶液消解了底泥, 降低了萃取时间, 可以减小萃取过程中所产生的泡沫, 使萃取溶液均一。但与水蒸气蒸馏相比, 回收率偏低。1. 4超临界流体萃取超临界流体萃取技术用于萃取底泥中的甲基汞, 回收率为50. 4±3. 8%9。对于富含巯基的底泥, 其萃取效率可达96%, 可与水蒸气蒸馏技术相媲美。所以在利用超临界流体技术萃取甲基汞时, 应考虑到底泥的基体效应, 而且在萃取系统中不能存在无机汞离子。装置的昂贵也限制了此种技术的发展。9332高效液相色谱柱用于汞化合物的形

12、态分离进行汞化合物的形态分析, 最常用的是反相高效液相色谱与各种检测器的联用, 分离汞化合物所用的色谱柱大都为OD S 柱, 仅有Sarzan in i 40等人利用D i onex 公司的阳离子交换柱分离了无机汞、甲基汞和乙基汞。色谱柱还向微型化方面发展, M unaf 34和Shum 50等人利用微柱液相色谱分离了甲基汞、乙基汞、苯基汞和无机汞。色谱的流动相通常包括有机改性剂(甲醇、乙腈等 、络合剂或离子对试剂, 若需要加入缓冲溶液调节流动相的pH 值。在测定实际样品中, 常有各种金属离子的干扰, 流动相中加入ED TA 后, 干扰效应可基本消除13, 15, 16, 20。在反相高效液相

13、色谱中, 常选用适当的络合剂和离子对试剂与汞化合物反应, 其作用是与样品中的汞形成非极性化合物而后在OD S 柱上进行分离。常用的络合剂包括:二乙基二硫代氨基甲酸钠(SDDC 15, 16, 19、SPDC16, 22, 25, 30, 32, 35, 36, 44、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(A PDC 29, 38、双硫腙13, 24和22巯基乙醇(M E 10, 14, 23, 41-43, 45-48, 51, 52。常用的离子对试剂包括:半胱氨酸33, 34, 37, 40, 49、四丁基溴化铵(TBAB r 17, 39、溴化钾26, 31、溴化钠和氯化钠28等。此外, 还有研究小组使

14、用了62巯基嘌呤18、甲基巯基乙酸酯11, 12、22巯基苯并噻唑(M B T 20、铋试剂 21、二十二烷基二甲基溴化铵(DDAB 27和戊基磺酸铵50做络合剂或离子对试剂。络合剂(A PDC 、半胱氨酸 的浓度对汞化合物的分离和保留有很大影响29, 30。若络合剂的浓度太低, 其与汞化合物的络合反应进行的不完全, 带电的未络合化合物与C 18柱上残余的硅羟基相互作用而引起的柱上吸收现象会降低进样的重复性。增大络合剂的浓度, 其与汞化合物的络合能力增强, 汞化合物能较快流出且灵敏度有所提高。但络合剂的浓度过高, 其在紫外检测器上的背景吸收也随之增大, 使汞络合物不能被检出或检测限很高。故当络

15、合剂的浓度很高时, 应选择冷蒸气原子吸收光谱仪(CVAA S 或其它元素特效检测器。M unaf 等人34报道利用半胱氨酸作为络合剂, 发现低浓度的半胱氨酸不能使汞化合物完全络合, 色谱峰呈现严重的拖尾效应; 而高浓度的半胱氨酸与汞形成的络合物在过硫酸钾化学氧化的条件下不能被完全破坏掉。22巯基乙醇曾与电化学检测器41,42, 43和元素特效检测器CVA FS 23, AA S 41, I CP 2M S 45-48, I CP 2A ES 51, M IP 52联用, 但并不适合于光度检测器16。SDDC 与汞的络合物在色谱柱上分离后的峰形比较宽而且不对称, 与其它金属与SDDC 络合物相比

16、, 检出限也较高一些16。汞2DDC 络合物在酸性或碱性溶液中均能被萃取出来, 但在酸性溶液中萃取易导致络合物的分解, 而且随pH 降低分解越厉害15, 16。在取氯仿层进样时, 色谱图上会同时出现络合剂质子化的色谱峰和甲基汞络合物的峰。若在碱性溶液中汞络合物能被定量萃取, 只有极少量的络合剂被萃取至氯仿层中, 而且在色谱柱上会很快流出, 不影响后面汞络合物的测定15。PDC 或DDC 的浓度过高, 会使基线噪音变大, 基线漂移非常严重, 故应维持最低水平16。这与Inoue 53的在pH 211范围内SDDC 能定量萃取有机汞的结论正好相反。能与双硫腙形成络合物的无机汞和大部分有机汞化合物在

17、pH 18范围内均能定量被萃取出来。与SDDC 相比, 在酸性条件下, 利用双硫腙萃取汞化合物没发现有机汞化合物的分解现象。汞2双硫腙络合物在氧化剂存在条件下会缓慢分解, 在-18下, 可保存24h 。流动相的pH影响汞2双硫腙的稳定性, 选择0. 05m o l L HA c , pH 413。R i o 2Segade 等人39和Ho 等人17曾经报道利用TBAB r 作为离子对试剂来分离有机汞化合物, 加入氯化钠可使峰形比较尖锐、对称, 而且可降低各种汞化合物的保留时间, 尤其是无机汞的保留时间。对于极性化合物无机汞和甲基汞来说, 在流动相中加入0. 1m o l L 溴化钾可增强其与固

18、定相的键合能力, 增大保留时间和灵敏度26。在65%乙腈作流动相时, SDDC 络合和分离有机汞的时间可长达30m in 。为将分离时间缩短至10m in , 需将乙腈含量提高至80%。在以I CP 2M S 作检测器时, 由于有机溶剂含量的增大, 则必须增大雾化器中氧气的含量, 从而导致汞的灵敏度降低10倍。故此时最好选择SPDC 作络合剂44。Falter 30以CVAA S 为检测器试验了M E 、半胱氨酸和SDDC 三种络合剂络合汞化合物的能力。发现SDDC 络合汞化合物能得到最大的灵敏度, 而且无机汞最后流出, 不影响环境样品和生物样品中较低含量的有机汞的测定。433测定方法与高效液

19、相色谱联用形态分析汞化合物的检测方法可大致分为三类:光度法(U V 2V is10-21 、原子光谱法如CVA FS 22-24、CVAA S 25-41和I CP 2M S 44-50、I CP 2A ES 51、M IP 52和电化学法(ECD41-43 。紫外2可见分光光度检测器(U V 2V is 是一种常规的高效液相色谱检测器, 能广泛应用于多种化合物的测定。但由于大部分有机物在254nm 均有吸收, 在测定实际样品时色谱图上出现许多杂峰(背景吸收 , 所以缺乏选择性; 而且随洗脱时间的延长, 基线漂移非常明显。选用475nm 的可见波段来检测汞2双硫腙络合物, 可使选择性大大提高1

20、3。电化学检测器(ECD 灵敏, 而且能同时测定多种有机金属化合物, 但需要特制的电极, 必须除去溶剂中的还原性物质, 而且选择性不高, 因此实际应用不广泛。原子吸收检测器(AA S 与高效液相色谱的连接是通过一石英流动池实现的, 是目前联用技术最成熟、应用最广泛的一种元素特效检测器。光谱干扰少, 运转费用低, 简单快速, 冷原子方法的采用使其灵敏度大大提高。原子荧光检测器(A FS 同样易于实现与高效液相色谱的联用, 两仪器通过聚四氟乙烯(PT FE 管相连, 简便快捷灵敏是其最主要的特点。目前其局限性在于汞的荧光易被多原子分子如氮气、氧气、水和有机流动相等淬灭, 从而使得H g 0的检测灵

21、敏度降低。一般采用以下几种方法除去:膜技术; 高氯酸镁; 硫酸; 在不同温度下冷捕集。实验证明, 膜吸收效果不大; 高氯酸镁吸收可提高灵敏度但其容量极低; 冷捕集的温度低于-5, 汞的还原反应变慢, 低于-15, 有机流动相会冷凝; 利用-20的硫酸效果最好22, 24。原子吸收和原子荧光光谱法测定有机汞时, 需提前将有机汞转化成无机汞, 常用的转化方法包括紫外灯照射20, 29, 30, 32, 35, 36和化学氧化法, 如重铬酸钾26, 31, 33, 37、过硫酸钾24, 34氧化法。电感耦合等离子体(I CP 质谱(M S 或原子发射光谱(A ES 能对样品进行连续检测, 检出限低而

22、且可实现多元素同时测定。将样品引入等离子体时通常采用常规雾化装置直接注入雾化(D I N 50或气动雾化(PN , 只能导入1%3%的样品, 有很大的死体积, 导致峰严重变宽。H uang 等人47采用超声雾化(U SN 装置, 通过设置合适的去溶剂化温度和冷凝温度使溶剂尽可能挥发的同时增大汞化合物进入等离子体的量,有效减小了峰变宽效应, 灵敏度也大大提高。W an 等人49采用冷蒸气(CV 发生可使进入等离子体的液体在氩气的作用下分散成极细的液滴, 能更加有效的达到气液分离的目的, 与直接注入雾化和气动雾化相比灵敏度可提高几十倍到几百倍。在与液相色谱联用时, 流动相中所含的有机改性剂的浓度较

23、高时, 其中碳的分解会使汞化合物的峰漂移, 影响汞化合物的检测灵敏度47, 因此绝大部分流动相中有机改性剂的含量在1%3%之间45-48。其最大不足在于昂贵的仪器费用和运转费用使得其应用不能普及。直流耦合等离子体(DCP 作为一种元素特效检测器其检测限高的原因在于甲醇和离子对试剂中高的含碳量导致的基线噪音的变大, 与U V 2V is 相比, 它对小分子化合物如甲基汞和乙基汞的灵敏度较高17。4展望高效液相色谱在分离和测定方面的特点使之在汞化合物形态分析中得到了日益广泛的应用。为了提高分离能力, 研究分离机理、发展色谱柱技术并探索新的分离方式是十分必要的。在测定方面, 各种光谱联用技术对于提高

24、测定的灵敏度和选择性具有重要意义。但由于目前在溶液传递和转换方面的困难, 大部分联用技术尚不成熟, 商品化的仪器系统尚未问世。随着环境化学研究水平的提高和越来越高的环境监测需求, 某些高灵敏度、高选择性和仪器成本较低的方法, 如高效液相色谱与原子荧光光谱仪的联用等技术会逐步发展成为适合我国国情的成熟的方法。参考文献:1H arada M . C ritical R eview s in Tox ico logy J ,1995, 25:1.2F riberg L , V o stal J , Eds . M ercu ry in the Environm en t M . CRC P ress

25、 :C leveland , O h i o , 1972.3Carson B L , E llis III H V , M cCann J L . Tox ico logy and B i o logicalM on ito ring of M etals in H um an s M . L ew isPub lishers , Inc . , M ich igan , 1986.4V allee B L , U l m er D D . A nn . R ev . B i ochem . J ,1972, 41:91.5M on tague K , M on tague P . M er

26、cu ry M . Gu inn Company , Inc . , U SA , 1971.1436W est G . A cta Chem . Scand . J ,1966, 20:2131.7Hovert M , B loom N S , L iang L . A nal . Ch i m . A cta J ,1993, 281(1 :135.8T seng C M , D iego A D e , M artin F M et al . J . A nal . A t . Spectrom . J ,1997, 12(7 :743.9Em tebo rg H , B j rk lu

27、nd E , O dm anm F et al . A nalyst J ,1996, 121(1 :19.10H empelM , H in tel m ann H , W ilken R D . A nalyst J ,1992, 117(3 :669.11Bettm er J , Camm ann K , Robecke M . J . Ch rom atogr . A J ,1993(1 , 654:177.12Camm ann K , Robecke M , Bettm er J . F resen iu s J . A nal . Chem . J ,1994, 350(1-2 :

28、30.13L angseth W . A nal . Ch i m . A cta J ,1986, 185:249.14W ilken R D , H in tel m ann H . W ater , A ir and So il po llu t . J ,1991, 56:427.15M edina I , R ub íE , M eju to C et al. A nalu sis J ,1993, 21(4 :215. 16L angseth W . F resen iu s J . A nal . Chem . J ,1986, 325(3 :267.17Ho Yen

29、2Sun , U den P C . J . Ch rom atogr . A J ,1994, 688(1-2 :107.18Park in J E . J . Ch rom atogr . J ,1986, 370(1 :210.19L angseth W . J . Ch rom atogr . J ,1988, 438(2 :414.20W ang Yao 2Ch in , W ang Chen 2W en . J . Ch rom atogr . J ,1993, 628(1 :133.21江霜英, 刘锦春, 刘良斌等. 高等学校化学学报J ,1992, 13(6 :759.22Fa

30、lter R , Ilgen G . F resen iu s J . A nal . Chem . J ,1997, 358(3 :407.23H in tel m ann H , H empel H , W ilken R D . Environ . Sci . T echno l . J ,1995, 29(8 :1845.24H in tel m ann H , W ilken R D . A pp l . O rganom et . Chem . J ,1993, 7(3 :173.25Falter R , Sch ler H F . Chemo sphere J ,1994, 29

31、(6 :1333.26Sch ick ling C . B roekaert J A C . A pp l . O rganom et . Chem . J ,1995, 9(1 :29.27A izp ún B , Fern ándezM L , B lanco E et al. J . A nal . A t . Spectrom . J ,1994, 9(11 :1279. 28Rob in son J W , Boo the E D . Spectro scopy L etters J ,1984, 17(11 :673.29Sarzan in i C , Sacc

32、hero G , A ceto M et al . J . Ch rom atogr . J ,1992, 626(1 :151.30Falter R , Sch ler H F . J . Ch rom atogr . A J ,1994, 675(1-2 :253.31W u J C G . Spectro scopy L etters J ,1991, 24(5 :681.32Falter R , Sch ler H F . F resen iu s J . A nal . Chem . J ,1995, 353(1 :34.33Pal m isano F , Zam bon in P

33、G , Cardellicch i o N . F resen iu s J . A nal . Chem . J ,1993, 346(6-9 :648.34M unaf E , H araguch i H , Ish ii D et al . A nal . Ch i m . A cta J ,1990, 235(2 :399.35Falter R , Sch ler H F . F resen iu s J . A nal . Chem . J ,1995, 354(3 :492.36E iden R , Falter R , A ugu stin 2Castro B et al. F

34、resen iu s J . A nal . Chem . J ,1997, 357(4 :439. 37Fu jita M , T akabatake E . A nal . Chem . J ,1983, 55(3 :454.38Q varn str m J , T u Q , F rech W et al . A nalyst J ,2000, 125(6 :1193.39R i o 2Segade S , Bendicho C . T alan ta J ,1999, 48:477.40Sarzan in i C , Sacchero G , A ceto M et al . A na

35、l . Ch i m . A cta J ,1994, 284:661.41Ho lak W . A nalyst J ,1982, 107(1281 :1457.42Evan s O , M cKee G D . A nalyst J ,1987, 112(7 :983.43Evan s O , M cKee G D . A nalyst J ,1987, 113(2 :243.44Falter R , Ilgen G . F resen iu s J . A nal . Chem . J ,1997, 358(3 :401.45Bu shee D S . A nalyst J ,1988,

36、 113(8 :1167.46Bu shee D S , M oody J R , M ay J C . J . A nal . A t . Spectrom . J ,1989, 4(8 :773.47H uang Chung 2W en , J iang Shu ih 2Jen . J . A nal. A t . Spectrom . J ,1993, 8(5 :681. 48B loxham M J , Gachan ja A n thony , H ill S J et al . J . A nal . A t . Spectrom . J ,1996, 11(2 :145.49W an Ch ia 2Ch ing , Shyue Ch ih , J iang Sh iuh 2Jen . J . A na