石斛属植物组织培养及遗传转化研究进展

1、石斛属植物组织培养及遗传转化研究进展张 建 勇 , 刘涛 , 袁 佐 清 (山东理工大学生命科学学院 , 山东淄博 255049摘要 石斛作为一种集药用和观赏于一体的珍稀植物 , 近年来其组培快繁和基因工程研究取得了比较大的进展。综述 了石斛属植物组 织培养外植体、 培养基、 增殖与分化、 遗传转化方法、 靶材料、 选择标记基因 和报告基因等方面的研究进 展 , 为石斛的 开发和利用 提供科 学依据。关键词 石斛 ; 组织培养 ; 遗传转化中图分类号 Q 943.1文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007 03-00656-02R e se a rch Pro g re s s

2、in D end r obiu m T is su e Cu ltu re an d G e n e tic T ran s fo r m a tio nZHANG J ia n -yo n g e t a l (S ch oo l o f L ife S cien ce , S h an don g U n iv ers ity o f T ech n o lo gy , Z ibo , S h andon g 255049A b s tra c t T h e tissu e cu ltu re , rap id p ropaga tion an d g en e tic en g in

3、ee r i n g o f D endrob ium p lan t h ave been advan ced obv iou sly inrecen t yea rs. Inth e pre-sen t paper th e p rog ress inits tissu e cu ltu re i n c l u d in g e xp lan ts , m edia an d cu ltu red m e th ods w ere ou tlin ed , th e advan ce i nits gen e tic tran sfo rm a tioni n v o lv-in g i

4、ntran sfo rm a tion m e th ods , ta rge t tissu e , se lection o f gen e s and repo rt gen e s w e re re v iew ed . T h e p rospect an d p rob leminth e tissu e cu ltu re and gen e tic en g in ee r in g o f th e D end rob iu m w e re a lso d iscu ssed.K e y w o rd s D endrob i um ; T issu e cu ltu r

5、e ;G en e tic tran s fo rm a tion石 斛 又名 石 斛 兰 (D. orch id s , 属 兰 科 石 斛 属 (D end rob i-um , 是兰科中 的第二大属 , 全球共有 大约 1500种 1, 我国 有 76种 2。中药上广 泛 使用 的石 斛 (H e rba D end rob ii 来自 兰 科 石 斛属 植物 的 茎 , 来源 于野 生 资源 , 国 内 国际 需求 量 日益 加 大 , 价格也越来 越 昂 贵。由 于 石斛 属 植 物被 过 度 采 挖 利用 , 加上生态环 境的 破 坏、 繁 殖 率低 和 生 长缓 慢 等 特点 ,

6、1987年 已被国 家列为濒 危 绝灭 的 植 物药 材 之 一。国 内 外 学者 利 用 组 织培 养进 行 石斛 的快 速 繁殖 , 以 提 高繁 殖系 数 , 解 决资 源 紧缺的问题 3。同时 成 熟 的组 织 培 养体 系 也 是遗 传 转 化 的 基 础 , 随着 组织 培 养技 术在 石 斛植 物 中的 广泛 应 用 , 石斛 基 因工程 研究也取得 了很大进展。1石斛属 植物的组织 培养现代药理 研究 表明 , 石斛 具 有 抗癌 、 防 癌、 抗 衰 老、 增 强 机体 免 疫 力、 扩 张 血 管、 抗 血 小 板 凝 集、 抗 辐 射 等 多 种 功 效 4, 因 此药用

7、石斛 中的一些珍 贵种 类成为 目前 离体 培养 研 究的重点 5-11。而国外主 要以观赏石 斛为主 , 着重于组织 培 养条件 的优化 12。1. 1 外植 体 石斛 离 体 培养 外 植 体的 取 材 来 源 较 广 , 有 种 子 5-6、 茎段 9、 茎 尖 13、 腋芽 14、 根 尖 15、 叶 16及 试管 苗 7等。在药用 植物组 织 培 养中 , 外植 体 的 选择 十 分 关 键 , 不 同 的取材部 位 和 取 材时 期 , 培养 的 结 果 也 不 一 样。 张 艳 等 17以金钗石斛 取材 部 位、 基 本培 养 基、 激 素 浓度 配 比 3因 素 进 行正交 试

8、验 , 结 果 表 明 , 取材 部 位 是最 敏 感 的因 素 。卢 文 芸 等 18用环草石 斛的茎段在 M S 培养 基中 培养 , 研究 了 不同 取 材的位 置对环草石 斛出芽的影响 , 结果表明 , 茎尖部位明显要 高于其他部位 , 茎中部次之 , 而茎基部几乎不能萌发 ; 茎段外植 体苗比种子苗成株快 , 茎粗 , 苗 壮 , 易成 活 ; 外植 体苗分 段增殖 时基部茎段的增殖系数 比上部茎段 大 , 生长速 度快 ; 继 代增殖 苗段比野生植株增殖快。1. 2 培养 基 选 择 合 适 的 培 养 基 是 组 织 培 养 最 关 键 的 一 步。 M S 3、 N 65、 B

9、 58及 KC 19等基 本 培养 基 , 均可 用 于石 斛作者简介 张建勇 (1977- , 男 , 山东商河人 , 硕士 , 讲师 , 从事植物资 源 和遗传 多样性研究。收稿日期 2006-11-09属植物的离 体 组 织培 养 , 但 效 果 不 同。 M S 和 1/2M S 是 离 体 培养最有 效和最 常用 的基 本 培养 基 3, 7, 11,1/2M S 培养 基 则 适宜生 根 9。王国梅等 20以野 生金 钗 石斛 茎段 诱 导长 出 的 原球茎 为材料 , 比 较了 M S 、 1/2M S 、 B 5、 M iller 4种 不同 基本 培 养基在 4个不同 培 养

10、 周期 中 金 钗石 斛 原 球茎 生 长 增殖 的 情 况 , 筛选出最佳增 殖培 养 基 B 5。不 同的 培 养目 的 , 所 对应 的 培养基也 不同。张治 国等 21研究 了 6种 不 同基 本 培养 基 对 铁 皮石 斛原 球 茎增 殖的 影 响 , 结果 表明 , 基 本 培养 基 对铁 皮 石 斛 原 球茎 增 殖 作 用 影 响 很 大 , 不 同 器 官的 适 宜 培 养 基 不 同 ,1/2M S 适宜原球 茎增殖 ; M S 适 宜种子萌发 、 茎段和 叶片培 养 ;N 6适宜种子 萌发、 叶 片培 养 ; 改 良 W h ite 、 KC 适 宜茎 段 培 养。曾宋君

11、等 22发 现 N 6培 养 基 对 石 斛 胚的 萌 发 和 生 长 最 好 , 而 以茎尖作为 培养材料 , N 6培 养基 诱导 愈 伤组 织 能力 明 显不如 M S 。朱 艳 等 23以 铁皮 石 斛 茎 段 诱 导 丛 生 芽 作 为 目 的 , 筛选出 1/2M S 诱导丛生芽 的效果好 , 生成的苗 粗壮。 在石斛的 组织培养中 , 以蛋白 胨和白糖 代替 蔗糖 进行 试 验 , 大大降低了快 繁 生产 中 的成 本 22。 M it ra 等 24利用 可 控 制的 CO 2气体作为 碳源 , 根 长与 叶 子的 数 量与 含 2%蔗 糖 培 养基中 的相等 , 组 培苗的干

12、重 和鲜重 都高于 含蔗 糖培 养基 的 组培苗 , 但是 CO 2对发根 影响不大。1. 3 增殖 与分 化 原 球 茎是 石 斛 试管 苗 繁 殖 的 关 键 , 其 增 殖与分 化情况直 接 影响 着 试 管苗 培 养 的成 功 与 否。目 前 多 以原 球茎诱 导、 增 殖、 分 化苗形 成与生 长、 试 管苗移 栽等培 养 条件的 研究为主 11, 16。添加植物 激素 K t 和 2,4-D 对 促进 霍 山石斛 试管苗生长和 继代增殖的 效果最 佳 7;N AA 对 金钗 石 斛原球 茎的增殖效 果明显好于 IBA, 在 不同激素 6-BA 和 N AA 配比组 合正交试验 中

13、, 处理 6-B A0.5m g/L +N AA0.2m g /L 的 配比为最 佳 激 素 组 合 20。 N AA 和 6-B A 有 利 于 鼓 槌 石 斛 组 培幼苗 的生长与分 化 19; 铁皮 石斛 原 球 茎诱 导 以 1/2M S 为 培养基 , 添加 BA 和 N AA 为佳 , 原球茎 分化 以 1/2M S 添加 BA 和 N AA 为佳 25; 适宜浓度的 G eO 2(5.00m g /L 能 够显 著增 加 铁皮石斛 原 球 茎 的鲜 重 26。 培 养基 中 加 入 天 然 提 取 物 , 对 组织器 官的形成 及 生长 也 有 影响 。齿 瓣 石斛 胚 培 养的

14、 最 适 培养基为 改良 N 6, 添加椰乳 可 以提 高胚 的 萌发 率 , 并 增加 繁 殖系数 , 香蕉汁 可 以加 速 幼 苗的 生 长 及促 进 生 根 5; 铁 皮 石斛以添 加椰乳对芽 的增殖效果最 好 8。2石斛的 遗传转化2. 1转化方 法 目前报 道的石 斛的 遗 传转 化主 要 通过 2种 方式进行 :基因枪 转化法和农 杆菌介 导法 。其中 基因 枪转 化 法应用较 多 , 成功 率 也较 后者 高 一些。 C ha ng 等 27将 兰花 花 叶病毒 (CM V 外壳蛋 白 (C P 基 因 用 微 粒 轰击 石 斛 的 原 球 茎 的 方 法 进 行基 因 转 移

15、, 在 含 有 潮 霉 素 的 培养 基 上 选 择 转 化 株 ,PC R 、 S ou th ern 、 N orth ern 以 及 W es tern 杂 交分 析证 实 了转 基 因 的存 在 ; 病毒 侵 染试 验表 明 , 转 化株 的 症状 明显 低 于非 转 化株。石斛 基因工程研 究缓慢 , 主要 因为兰 科植 物对 根癌 农 杆菌或 发根农杆 菌 不敏 感 , 缺 乏 合 适的 表 达 载体。 Y u 等 28首先将经薄 层切片 处 理的 类 原 球茎 与 农 杆菌 在 无 抗生 素 的 培 养基 上共 培 养 , 卡拉 霉素 用 于石 斛 兰转 化子 的 筛选 , 选

16、择 培养 68周后得到 转基因植 株。遗 传转 化主 要以 原 球茎 或 愈伤组织 作 为 靶 材 料。原 球 茎 易 诱 导 , 转 化 后 也 易 分 化 成 苗 , 但原球 茎 遗 传 转 化 后 易 产 生 嵌 合 体 , 不 利 于 鉴 定 筛 选 。 T ee 等 29使 用不同 类型 的 愈 伤 组 织 及 离 体诱 导 的 花 序 顶 端 组织作 靶材料对石 斛兰中的一个 种 S on ia 17进行转化 , G FP 的 表 达率 都较 高 , 但 后期 培养 中 , 以 花序 顶 端组 织为 靶 材料 轰 击的个 体成活率低 。2. 2选择标 记基因及报 告基因 石 斛遗

17、传转 化中 常 用的 选 择标记基因 有 潮 霉素 磷 酸 转移 酶 基 因 (hp t 30, 选 择 培 养 中 使用潮 霉素 (H yg 作为 选择剂。 M en 等 31建 立了 稳定 的农 杆 菌介导转化 原球茎 的方 法 , 使用 hp t 基因 作 为标 记 基因 转 化 金钗石 斛 , 转化 效率高达 18%;S ou the rn 杂交和 GU S 组织 化学 分析也表 明了基因的 整合与 表达。 GU S 具良好 的 稳定 性 , 灵 敏 度高 , 易 于检 测 , 是 目前 植物 基 因工 程 研究 工作 中 使用 最 广泛 的 一 种 报 告 基 因 30-32。 近

18、年 来 , 绿 色 荧 光 蛋 白 基 因 (GF P 作 为一种新型 的报告基因 开始在植物 基因转化 及基 因 表达调 控研究中得 到应用 , 并 显示出 较其他 报告 基因 更大 的 优越性 :无需底 物、 酶、 辅因子等 物质 ; 便 于活体 检 测 ; 检测 时 只需光 照 , 对细 胞无毒害作用 30。3石斛研 究展望石斛组织 培养研究大 多集中在快 速繁 殖、 扩 大繁 殖系 数 方面 , 已在多种 石斛 中 成 功培 育 出 试管 苗 5, 7, 9。 今后 应 加 强石斛 的基础性研 究 , 如共生 菌、 光照、 温 度、 湿 度、 栽 培基 质 等 对石 斛生 长 发育 的

19、影 响 , 掌 握石 斛 生长 发育 的 营养 需求 、 物质合 成与分解等 新陈代谢规律 , 确 定石斛 类群 生长 的最 佳 生态 环境 , 结合大 田栽培 , 从根 本上解 决石斛 资源短 缺问题 。 要实现 药用石斛植 物资源的可持 续开 发 , 大 规模 产业 化生 产 是离体 培养的发展 趋势。药用石斛 离体培养物 的化学成分 、 作用 与天 然野 生品 相 同 , 直接以组织 培养物替代使 用原药 材或者 生产 活性 成分 也 是解决 石斛资源短 缺的方法之一 , 但 目前涉 及该 方面 的研 究 还很少。石 斛植物 中 含 有多 种 生 物碱 、 抗癌 菲、 类 黄 酮 等 物

20、 质 , 组 织培 养过 程 中次 生代 谢 产物 的 研究 对石 斛 尤为 重要 , 以便通 过生物技 术 获取 这 些 药用 成 分。 深入 了 解 次生 代 谢 产 物的 产生 及 积累 动态 , 通 过 调控 培 养条 件、 添加 前 体化 合 物等方 法提高活性 成分的产量 , 以探 讨组织 培养 物代 替药 材 使 用的 可能 性 ; 或 者建 立有 效 的生 物 反应 器 , 直接 生 产活 性成分 , 能有效解决 药用石斛资 源短缺。通过遗传 转化 , 导 入花 色、 花 期、 株 型 等 目 的 基 因 , 一 方 面可以 提高和改善石 斛兰的观赏 价值 , 另一 方面 可以

21、 创造 新 品种 , 为石斛兰提 供了丰富的 育种资 源。石 斛组 织培 养和 基 因 工 程 也存 在 很 多 问 题 , 试 管 苗 移 栽 成 活率 有 待 进 一 步 提 高 ; 生长十分缓慢 , 周期长 , 规模 小 , 成本 高 ; 石 斛对 农 杆菌 敏 感性差 , 转化率低 ; 基因枪 转化嵌 合体 较多 等等。 总之 , 随 着 石斛组 织培养技术的 完善 , 基 因工程 改良石 斛品 种技 术的 成 熟 以及 工业 化 生产 技术 的 发展 , 这 些问 题 将逐 步 得到 解决 , 有望缓 解当前石斛用 量大、 植 物资源匮乏 的紧张状况 。 参考 文献1L A V A

22、RA C K B,H AR R IS W ,S T O C K ER G. D end rob ium a n d its re la t iv e s M . P o r tlan d:Ti m be r P re ss ,2002:14.2吉占和 . 中国石斛的初步研究 J . 植物分类学报 ,1980,18(4 :427-449. 3傅玉兰 , 张志平 , 姚萍 . 春石斛组培快繁技术研究 J . 安徽农业科学 , 2006,34(3 :464-465.4陈晓梅 , 郭顺星 . 石斛属植物化学成分和药理作用的研究进展 J. 天 然产物研究与开发 ,2001,13(1 :70-75.5丁长

23、春 . 齿瓣石斛的胚培养技术及其快速繁殖研究 J. 热带农业科 技 ,2004,27(3 :10-11.6陈之林 , 曾宋君 , 段俊 . 独角石斛的离体繁殖 J. 植物生理学通讯 , 2004,40(3 :342.7傅玉兰 , 谷凤 , 胡传明 , 等 . 霍山石斛组培快繁技术研究 J. 安徽农业 科学 ,2004,32(3 :522-523.8周俊辉 , 钟雪锋 , 蔡丁稳 . 铁皮石斛的组织培养与快速繁殖研究 J. 仲 恺农业技术学院学报 ,2005,18(1:23-26.9孙廷 , 杨玉珍 , 陶杰 , 等 . 金钗石斛的组织培养和快繁技术 J. 山东农 业大学学报 :自然科学版 ,2

24、005,36(1:47-50.10卢文芸 , 唐金刚 , 乙引 , 等 . 五种药用石斛快速繁殖的研究 J. 种子 , 2005,24(5 :23-25,28.11孔琼 , 袁盛勇 , 查应洪 , 等 . 梳唇石斛成熟胚的离体培养和植株再生 J. 植物生理学通讯 ,2005,41(5 :644.12RO YJO N O J IT,B AN E R JE E N IRM A L Y A. I n du c tiono f ca l lu s a n d p la n t re ge n e r-a tionfromsh o t -tip e xp lan ts o f D en d ro b i

25、um fi m b ria tum L in d 1.v a r.o cu la tum H K.F J.S c ie n tia H o r ticu l tu ra e ,2003,97:333-340.13张启香 , 方炎明 . 铁皮石斛组织培养及试管苗营养器官和原球茎的结 构观察 J . 西北植物学报 ,2005,25(9 :1761-1765.14付志惠 , 李洪林 , 杨波 . 广东石斛的组织培养 J. 植物生理学通讯 , 2005,4l(4 :491.15詹忠根 , 徐程 , 张铭 , 等 . 铁皮石斛离体根尖经体细胞胚再生植株研究 J. 浙江大学学报 :农业与生命科学版 ,20

26、05,31(5 :579-580.16KP M A R T IN,JO S E P H M A D A S SE R Y.R ap id in v itr o p ropa g a tio n o f D end ro b i-um h yb r ids th r ou g h d ire ct sh oo t fo rm a t ionfromfo lia r e xp lan ts an d p ro to co rm -lik e bo d ie sJ .S c ien tia H o r ticu l tu ra e ,2006,108:95-99.17张艳 , 范俊安 , 李泉森 ,

27、 等 . 金钗石斛培养初步研究 J. 时珍国医国药 , 2001,12(2 :189-190.18卢文芸 , 张宇斌 , 唐金刚 , 等 . 环草石斛快速繁殖研究 J. 贵州师范大 学学报 :自然科学版 ,2004,22(4 :15-18.19徐 红 , 刘峻 , 王峥涛 , 等 . 鼓槌石斛组织培养研究 J . 中国中药杂志 , 2001,26(6 :378-381.20王国梅 , 韦鹏霄 , 岑秀芬 . 基本培养基和激素组合对金钗石斛原球茎 增殖的影响 J. 广西农业科学 ,2006,37(1 :10-12.21张治国 , 刘骅 , 王黎 . 铁皮石斛原球茎增殖的培养条件研究 J. 中草

28、药 ,1992,23(8 :431-433.22曾宋君 , 程式君 . 石斛的试管苗快速繁殖 J. 中药材 ,1996,19(10 :490 -491.23朱艳 , 秦民坚 . 铁皮石斛茎段诱导丛生芽的研究 J. 中国野生植物资 源 ,2004,22(2 :56-57.24M IT RA A,D E Y S,SA W AR K A R S K.P h o toa u tro ph ic in v itro m u ltip lica tion o f th e o rch id D end rob ium u n de r CO 2e n r ichm en tJ.B io log ica l

29、 P lan ta rem,1998, 41(1:145-148.25蒋波 , 杨存亮 , 黄捷 , 等 . 铁皮石斛原球茎生长分化及生根壮苗研究 J. 玉林师范学院学报 ,2005,26(3 :66-69.26唐凤 , 丁小余 , 丁鸽 , 等 . 锗对铁皮石斛原球茎的生长及抗氧化酶系的 影响 J . 南京师范大学学报 :自然科学版 ,2005,28(4 :86-89.27CH AN G CH,C H E NY CH,H SUY H,e t a l.T ran sg en ic re sis ta n ce to C ym b id i-umm o sa ic v iru s in D en

30、d ro b ium e xp re ss in g th e v ira l ca ps id p ro te in ge n eJ. T ra n sg en ic R e se a r ch,2005,14:41-46.(下 转第 670页 (上接 第 657页 28Y U H, YA N G S H, G O H C J. A g rob acte rium -m e d ia ted tra n s fo rm a tion o f a D end ro b ium o r ch id w ithth e c la ss 1k n o x g e n e DO H I J .P la