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文档简介

1、精选优质文档-倾情为你奉上cDNA的合成实验原理和操作步骤一、实验目的掌握植物cDNA合成的原理和方法二、实验原理主要用于体外cDNA的合成。目前最常用的(reverse transcriptase) 有SuperscriptII、M-MLV和AMV等。它们具有依赖于RNA或DNA的DNA活性和RNaseH酶活性，可以以RNA分子为模板，合成出一条DNA链。形成的DNA是与RNA模板互补的，因而反转录产生的DNA分子称之为cDNA。三、实验材料、器具及药品 植物总RNA溶液。 紫外、口罩、手套、EP管架、DEPC处理过的枪头、EP管等。 5×M-MLV RT Buffer、 2.5m

2、M dNTP mix 、 RNase抑制剂(30U/µL)、M-MLV Reverse Transcriptase、 Oligo(dT)18 primer、无菌的DEPC水等。四、实验步骤注意：戴手套进行以下操作，严防RNase污染。1在上吸取1ml无菌水到EP管中,加入2µl植物总RNA溶液,充分混匀，在紫外上测定260,280nm的光吸收值(OD 值),然后计算RNA的浓度,并分析其纯度。分光光度（紫外吸收）法（1）预热紫外分光光度计1020分钟。 （2）取两只，一只装入1ml H2O溶液，作为空白溶液，用来校正分光光度计零点及调整透光度至100。（3） DNA纯度及浓

3、度测定： 取2ul DNA或RNA样品加入另一，加dH2O 至1000ul, 混匀。 将两只比色杯置分光度计中，调入射光波长，分别用空白溶液调整零点（T为100，OD为0），测定待测样品液在260nm、280nm、230nm的OD值。 计算浓度：对于双链DNA 1.0 OD260=50ug/ml, 对单链RNA1.0 OD260=40ug/ml。测定纯度： v纯的RNA溶液其OD260/OD280 的比值应介于1.7至2.0，OD260/OD230的比值应大于2.0。 ØRNA样品OD260/OD280的比值太小，说明有蛋白或苯酚污染。比值大于2.0，则可能被异硫氰酸胍污染。 

4、16;OD260/OD230的比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。 纯的DNA溶液其OD260/OD280应为 1.8，OD260/OD230应大于2.0。ØOD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。 ØOD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如、酚等。2在DEPC处理过的Ep管中加入约4µg总RNA和1µl 0.5µg/µl的 Oligo(dT)18 primer,小心混匀, 70保温5分钟,立即浸入冰水中。3按次序分别加入下列试剂：5µl 5×M-MLV RT Buffer2µl dNTP mix(2.5mM) 1µl RNase抑制剂(30U/µL) 1µl M-MLV Reverse Transcriptase 然后加DEPC水到25µl.4 小心混匀

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