Sequenom_SNP实验过程说明.

1、Sequenom SNa验过程说明文件目录一、实验基本流程及原理（1二、实验过程（21、引物设计（22、DNA 提取（33、PCR扩增（34、PCR产物碱性磷酸酶处理（35、单碱基延伸（46、树脂纯化（57、芯片点样（58、质谱检测（5(5三、附录实验所需的试剂、耗材和仪器设备、实验基本流程及原理Sequenom MassARRAY?SNP 检测过程结合多重 PCR技术、MassARRAY iPLEX单碱基延伸技术，和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术 (matrix-assisted laser desorption/ionizatiorrtime of flight,MALDI

2、-TOF 进行分型检 测。将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，再使用特异的延伸引物 与PCR产物进行单碱基延伸反应。由于多态性位点碱基不同，延伸产物不同的末端 碱基将导致延伸后的产物分子量的差异，因此由SNP多态性引起的碱基差异通过分 子量的差异而体现，通过基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析质谱技术，检测 延伸产物分子量的大小，应用专用的分析软件，通过判断分子量的差异而进行 SNP分 型检测。SNP检测实验基本步骤如下图所示：eV?* J图1 Sequenom MassARRAY? SNP检测实验基本步骤二、实验过程1、引物设计使用 Sequenom公司 Genotypin

3、g Tools 及 MassARRAY Assay Design 软件设计 待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，并交由生物公司合成。2、DNA提取使用 Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega 或 NucleoSpin Tissue (MN 等试剂盒或类似产品，提取组织、细胞或血样中的 DNAo用分光光度计定量，琼脂糖 凝胶电泳质检，基因组DNA电泳条带通常不小于20kb。质检合格的DNA将浓度调 整到50ng/转移至384孔板,-20C储存备用。塘采用等 PCR搜术 在一湖 孔舐中进行1坛个反腐体系晶体量为裕.1 ) ff一个新在L

4、SiiM FP 营锌 1 轴 PCRmix 用液.Kti FCR nustev mH ：PCR MFm月Mm . iL10* PCR Butter31MqCU (25WJ04CRTP w t i；5fliN- 010.1Water1.9PC宜中7附所 e：土1Tot«l W&um4(2 )使用24遍1加样的 情节加样柝为4ilL,在溺孔醐晦个加样入PC inasler mis滥.诬3M孑庚即为KH度应街.，i 百出日昭叁好的DMA择品4a4孔粒.使用14睛遇帕祥器调书加洋伸怛为1R 每个淞1代附曲曲系中包含横板口附 M-W ng HoUtHlaqOSU ,每架F 弓I柳U力修

5、出 0 1W的25fiiIVdNT P、.4 1在算客她4孔梅的PC R惶1宜上PCR炭应盛仲为包4汇4神的 <20的！ 利 ire 1必科 姑 个源球;7?'C 3分长1 ; 4/ 川片.将儿PCK反 柝放置于PC"徵上，启动PC A反应.4、PCR产物碱性磷酸酶处理(1 在 PCR反应结束后，将 PCR 产物用 SAP(shrimp alkaline phosphatase碱性磷酸酶处理，以去除体系中游离的dNTPs。(2配制碱性磷酸酶处理反应液，SAP Mix。汕PMbt对每个反应,nLWater1.53SAP Buffer (10x)047SAP Enzyme

6、(UU/ul)03Total Volume2板。(3使用24通道加样器，调节加样体积为2心将SAP Mix加入384孔PCR反应SAP Mi M而甲r反js . ulWMerL53SAP 83后 门也 J0,175A1-工Zymt (IJJ.'u:i0.3TbM Vlurri I2FTF的个墀亚嗝夏由阳GRXEK第息祢忸向i 3.雇中kk riw twt A 温合液 2 pl (SAP 031Mxjfrer 0 17 期E 招3A4子戚放置在泰客mwi孔板的PCRf£t设定PCR网应宗件37T 40分许 与分钟：1C堆持,启动PC H攸进行辄性碉酗fc处理.k单却基延伸- 1

7、 ：长做性厚酸能就训诘中后,迸行学虹如伸收阿 段R悻聚白体枳9 4.；2 配制量逅曰延值七施溥EXTEM- M *. J 士、EKTFNDMik. pl附IfttTG.61?fMt«?i(Jpr(mfr M* 】or 20.94IPLEX 加 pluiOJPlFX hLrrrtinator0JJFKFX enjyme0N】ibtal Vdume(4将384孔板放置在兼容384孔板的PCR仪上，设定PCR反应条件:I. 94o C for 30 secondsII. 94o C for 5 secondsIII. 52o C for 5 secondsIV. 80o C for 5 s

8、econdsV. GOTO III, 4 more timesVI. GOTO II, 39 more timesVII. 72o C for 3 minutesVII. 4o C forever启动PCR仪进行单碱基延伸反应。6、树脂纯化(1将Clean Resin树脂平铺到6mg的树脂板中；(2加16小水到延伸产物的对应孔内；(3将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30分钟，使树脂与反应物充分接触；(4离心使树脂沉入孔底部。7、芯片点样启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪，将树脂纯化后的延伸产物移至 384孔 SpectroCHIP (Seq

9、uenomE片上。8、质谱检测将点样后的 SpectroCHIP芯片使用 MALDI-TOF(matrix-assisted laser desorption / ionization Jime of fligh,基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析，检测结果使用 TYPER 4.0软件(sequenom分型并输出结果。三、附录实验所需的试剂、耗材和仪器设备关键试剂Code Reagents Manufacturer Cat No.1 Complete iPLEX? GoldGenotyping Reagent Set 384Sequenom10148-2关键仪器Code Instruments Manufacturer2 S1000TM Thermal Cycler BIORAD3 Pipette single channel Eppe