DosRregulon分子检测手段

1、DosR regulon 分子 检测手段结核潜伏感染对于结核在人群中的传播起着十分重要的作用， 而细菌中的休 眠调节子DosR与结核分枝杆菌休眠密切相关。通过聚合酶链反应( PCR技术 将其中的一个基因进行扩增， 测定序列并进行生物信息学分析。 结果显示， 基因 长度为1020 bp所编码蛋白为6-磷酸果糖激酶，参与细菌中间代谢和呼吸作用。 该蛋白由339个氨基酸组成，分子量为35401.4 Da等电点5.6648;不包含信号 肽，不是分泌型蛋白质；二级结构中B转角占46.61%, a螺旋占33.63%, B折叠占 19.76%;预测跨膜蛋白数 0 个，最大疏水指数为 2.411，最小疏水指数

2、为 - 2.372。Rv2029c基因在人型结核分枝杆菌标准株和 BCG标准株间无差异，理论 上可以通过检测其存在情况来判断病人是否存在潜伏感染。结核病，结核潜伏感染，休眠调节子DosR生物信息学分析结核病( tuberculosis，TB )是由结核分枝杆菌 (mycobacterium tuberculosis， MTB)所引起的以呼吸道感染为主的慢性传染病，其每年200万的死亡率以及超过 800 万的新发病例数使其在数十年间居于全球各种疾病危害的前列。 无论种族 和国籍、无论贫富、不分性别、不分年龄，都是 TB 的易感人群，在世界各个区 域，都存在着 TB 的流行。其主要传染途径是飞沫传

3、播 1 。1、流行概况WHO 估计， 2013年全球有 900万人口感染了结核病， 其中有 150万人死于 结核感染 (WHO, 2014)。全球结核感染率为 1/3，而我国结核感染者占人口总数的 44.5%，在世界上结核发生高负担的二十二个国家中名列第二。结核的流行严重 影响着中国人民的健康 2。由于我国庞大的人口基数，使我国结核潜伏人群成为 新发病例的最主要来源 3 。近年来，虽然政府对于结核病的防治愈发重视，但由 于管理制度不完善、没有快速的检测方法等原因，我国对于结核病诊断的漏诊、 误诊及诊断与治疗的延误情况仍不容乐观 4。因此，寻找快速准确诊断结核病的 方法对于我国更好地控制结核病在

4、人群中的传播和实现结核病的 “三早”预防有 十分重要的意义。2、潜伏感染结核潜伏感染 (1atent tuberculosis infection，LTBI) 是指结核菌在潜伏感染者体 内是以一种缓慢代谢的休眠菌形式存在。 机体在免疫力低下时， 休眠菌有可能转 变成为代谢活跃细菌，引发活动性结核病 5 。全世界感染结核人群中有超过 95% 为LTBI，是结核发生的重要来源。LTBI难以检测，MTB在结核患者体内以休 眠的形式存在，也有些活动性结核在药物的作用下进入休眠。 LTBI 无临床症状 体征，且细菌学与放射学检查为阴性，仅可通过结核菌素皮肤试验或 丫干扰素释 放试验检测 7 。3、检测手

5、段3.1 涂片与培养WHO 所推荐的肺结核诊断方法即为痰涂片检测抗酸杆菌，这是全世界的结 核实验室细菌学检测时所使用的基本方法。 本方法不但可明确传染源， 且价格低 廉，操作简便，十分适合于我国的国情。然而，涂片检测也有很多缺点，如检测 时间较长，一般需要 5-8 周才可以得出结果；检出率很低，仅有 14-47；特 异性不高， 各种分枝杆菌都可以着色， 仍需要进一步辨别是否是结核菌； 不能区 分死菌活菌 8 。3.2 结核菌快速检测系统 结核菌快速检测系统是上世纪七十年代出现的一种新的结核细菌学检测方 法，利用结核菌快速培养、药敏检测等技术，使检出时间由原来的 5-8 周缩短到 了 3-4 天

6、，且操作简单、自动化程度较高、灵敏度高。然而由于操作所需仪器与 试剂依赖于进口，价格十分昂贵，不能推广 9 。3.3 结核菌素皮肤试验 ( TST)TST 属于细胞免疫功能检测方法，其用于检测诊断 LTBI 至今已应用了一个 世纪。其判断是否为潜伏感染的依据是结核菌素纯蛋白衍生物 ( PPD) 对结核病 人进行皮肤试验阳性或近期由 PPD 阴性转为阳性。然而此方法存在许多缺陷， 难以有限分辨结核感染与卡介苗接种。 且其检测的敏感性不高。 甚至存在活动性 结核病患者的 TST 结果可能是阴性或弱阳性 10 。3.4 酶联免疫吸附试验( enzyme linked immunosorbent as

7、say ， ELISA)ELISA 是在结核抗体的测定中应用最多的一种试验方法，主要通过检测病 人血清中结核杆菌特异性抗体来检测结核。 但是由于结核分枝杆菌抗原性弱、 种 属间存在共同的抗原决定簇、 且其与体液免疫方面的相关性并未阐明， ELISA 检 测从 1983 年于我国开展以来，很难取得实质性进展 11 。3.5 丫 -干扰素释放试验 (interferon-gamma release assay, IGRA)IGRA 是近年来检测结核菌感染的一种新方法，以 T 细胞的免疫为基础，原 理是机体感染过结核杆菌后， 当血液中的特异性淋巴细胞再次接触结核菌的特异 性抗原时，会合成分泌出相应的

8、细胞因子 一一丫干扰素，而我们则可以通过检测 丫干扰素来判断病人是否感染结核。这种方法被证实在诊断MTB时有着较高的特异性，在欧美国家已成为一种临床上检测结核的常规方法。 具体方法有浓度法 的Quanti Feron TB Gold In-Tube和斑点法的T-SPOT.TB。虽然此方法有较高的特 异性与敏感性，但检测费用十分昂贵，难以在我国普及 12 。随着科学技术的发展， 我们对微生物的研究渐渐从传统的细菌实验演变成为 分子实验，使我们在征服结核的道路上拥有了更多研究方法与更好的解决途径。 从分子角度来说，MTB在人体内的休眠是受细菌Dos系统介导和调节的13 oDosR 是MTB进入休眠状态的关键转录调控子，该系统包括两种感受器(DosS和DosT) 及1种反应调节