猕猴桃细菌性溃疡病菌检疫技术操作办法

1、精品文档猕猴桃细菌性溃疡病菌检疫技术操作办法字体：大中 小 2009-9-1来源：省林检局阅读：160 次 关 闭 1 主题内容及应检范围1.1 本办法规定了猕猴桃细菌性溃疡病菌 Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al. 的检疫检验及检疫处理操作办法。1.2 本办法适用于林业植物检疫机构对猕猴桃属 Actinidia spp.植物活体、残体的检疫检验和检疫处理。2 产地检疫2.1种苗繁育基地的建立培育的猕猴桃，应从无病区采集接穗，或用无病虫的当年生半木质枝条作插条。加强晚秋水、肥管理，避免在强风和冬季低温的高海拔区，即易发生霜冻的地

2、方建园。2.2踏查在种苗繁育基地、猕猴桃栽植地的果园、林场，以自然界线、道路等为单位进行线路（目测）踏查。调查寄主的主干及分枝上部是否有淡黄色或黄褐色病斑；病斑处是否有小孔，从中向外流出白色或铁锈色液体，病部下方形成深褐色污斑。调查枝条上是否有暗绿色或暗褐色水渍状纵向、线形龟裂；新梢是否呈暗褐色萎蔫枯死，病部浸出白色水渍状液体。调查叶片上是否有红色小点，或大小为 2 3 mm 的褐色多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈，叶片向里或向外翻卷。确认有疫情需进一步掌握危害情况的，需设标准地（或样方）做详细调查。2.3标准地（或样方）调查种苗繁育基地样方设置与调查样方的累积面积应不少于调查总面积的 5

3、%。每块样方面积为 0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树 510 株，进行病害分级调查。果园标准地设置与调查按果园面积设置， 10 hm2 以下（含 10 hm2）设 1 块，每增加 5 hm2 增设1 块。.精品文档每块标准地面积为 0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树 10 株，进行病害分级调查。2.4 病害分级标准单株病害分级标准级全株叶、蔓无病代表值0；级120片叶和 1 个侧蔓发病，或 1/3 以下的新梢发病代表值 1；级2130 片叶和 23 个侧蔓发病，或 1/31/2 的新梢发病代表值 2；级31片以上叶和 12 个主蔓发病，或 1/2 以上新梢发病代表值 3；级主

4、干发病 1/3，或多数侧蔓发病、植株部分枯死代表值 4；级主干发病 1/3，或全部主蔓枯死发病、全株枯死代表值 5。果园病害分级标准（以被害株率为标准）轻被害株率 10%以下；中被害株率 11%30%；重被害株率 31%以上。2.5所采集的感病材料应包含植物的所有部分和各种症状部分。应尽可能采集感病初期的病株部分，以利于病原细菌的分离。2.6样品置于聚乙烯袋内或其它合适容器内保鲜和防止污染。样品应冷藏存放，避免受到阳光的照射。3 调运检疫3.1抽样比例苗木 100 株以内（含 100 株）的应全部检查；1001000 株按 10 %抽取；1000 株以上按一批货物总件数（株）的 5 %抽取。植

5、株及植株残体应全部进行检查。3.2抽样方法苗木按照抽样比例，采取分层方式设 5 个样点进行抽样。对携带有病症的植株及植株残体应全部进行检查。3.3现场检验检查寄主的叶片是否向里或向外翻卷，并有红色小点或多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈。检查 12 a 枝条上是否有水渍状纵向、线形龟裂，新梢是否萎蔫枯死，并有白色水渍状液体溢出。检查寄主干部是否在病斑下方呈深褐色并有铁锈色液体溢出。4 检疫检验4.1 溢菌检验 在具典型症状的病部上，取病健交界处的一小块病组织，在显微镜下切片检查是否有大量细菌液溢出。.精品文档4.2分离培养检验取小块病斑组织，经表面消毒，灭菌水洗 3 次后，研碎静置 10 m

6、in，采用假单孢属选择性培养基进行分离，将分离并经纯化后的细菌移植到 BPA 培养基斜面上培养 48 h，置 8 冰箱 保存。分离鉴定方法见附录 1。检查在 BPA 培养基平板上是否形成污白色、圆形、全缘、凸起、光滑、直径约为 13 mm 的菌落；在 KBA 培养基上未见荧光；在 Luisetti 培养基上发生蓝色荧光及在 SPA 培养基上呈粘液状菌落。4.3染色检验鞭毛染色 采用西萨基尔染色法。经染媒 57 min水 洗干燥 苯酚品红染色 5 min水洗 干燥后镜检。显微镜下菌体和鞭毛为阴性反应，呈红色，极生 13 根。革兰氏染色 采用结晶紫草酸胺染色法 。经固定 涂片 染色 1 min水洗

7、数秒吸干 碘液 处理 1 min 水洗数秒吸干 褪色 30 s水 洗数秒吸干复染 10 min 水洗吸干后镜检。显微镜下菌体为革兰氏阴性反应，呈红色。4.4生理生化检验生长与温度试验菌株生长最高温度为 35 ；最适生长温度为 2528 ；致死温度为 55 条件 下 10 min。精氨酸双水解酶检验 配制 Thornley 培养基。每试管装 3 4 ml 培养基灭菌 冷却 针刺接种细菌至培养基底部 立即用灭菌凡士林封管在 27条件下培养 7 d。在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。果聚糖（ Levan）试验 用细菌悬浮液，在 SPA 培养基上，或用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在

8、25条件 下培养 3 7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。在此条件下，在 SPA 培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。冰核活性测定 用直径 16 mm 的螺口试管，装浓度大于 168 CFU/ml 细菌液 35 ml，加盖置于4水浴 中（水浴含 11.2%的食盐水） 。如此液 在 5 min 内结冰，表明有冰核活性。在上述条件下，菌液经测定为无冰核活性。4.5碳素化合物的利用和分解碳素化合物产酸试验 配制 Ayers 培养基 。在适温 下放置 45 d 后，每 5 ml 培养液接种 0.1 ml 含 108 CFU/m

9、l 的菌悬浮液，适温下培养 34 周，产酸时培养液变为黄色。在此条件下，培养液变为黄色，能利用葡萄糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖产酸。.精品文档试验（产生 3羟基丁酮试验） 将细菌接种于甲基红试验用培养液，培养 24 d，按每毫升加 40% KOH（含 0.3% 肌酸或肌酐）0.1 ml 溶液，置 48 50水 浴中，充分摇动 2 h，在 4 h 内观察出现红色为阳性反应。在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。甲基红试验（MR 试验）将细菌接种于葡萄糖蛋白胨培养液，适温下培养 24 d 以上，取培养液 5 ml ，加甲基红试剂 23 滴。培养液变红色为阳性反应，黄色为阴性反应。在此条件下，培养

10、液测验为阴性反应，呈黄色。4.6氮素化合物的分解硝酸盐还原试验将硝酸盐半固体培养基用 4% NaoH 调节 pH 至 7.07.2。每 支试管分装 510 ml 培养基灭菌，针刺接种细菌 。试管培 养 3、5、7 d 后，分别用 GriessLiosvary 试剂测定法测定亚硝酸。如呈红色，表示有亚硝酸根为阳性反应。在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。吲哚试验配制胰蛋白胨 10.0 g、酵母膏 5.0 g 、蒸馏水 1000.0 ml 的培养液，接菌后适温培养。将滤纸剪成小条，在饱和草酸溶液中浸过后取出，灭菌烘干后，夹在棉花塞和管壁之间，使滤纸悬挂在不接触培养液的液面上，有吲哚产生的滤

11、纸变淡红色。在此条件下，滤纸不变淡红色，不产生吲哚。4.7大分子化合物的分解明胶液化在 BPA 培养基中加 10%12%的明胶，每支试管 410 ml，在 121灭 菌 1215 min，冷却后用穿刺法接菌，在适温中培养 3、7、14 和 21 d，将试管取出置冷水和 4冰箱中，使明胶凝固，检查明胶是否凝固或液化，并以未接菌的明胶作对照。在此条件下，该菌株不能使明胶液化。石蕊牛乳反应 用石蕊牛乳培养液，间歇灭菌 3 次，每次通蒸气 2030 ml 。接种后 于 28条件 下培养，以不接种的石蕊牛乳作对照，定期观察 4 6 周。在此条件下，石蕊牛乳反应变蓝，示有微碱性。吐温 80 的水解采用 S

12、ierra 方法测定。将吐 温 80 高压蒸气灭菌后，取10 ml 加入蛋白胨 10 g、CaCI·2H2O 0.1 g、琼脂 17 g、蒸馏水 1000 ml ，pH 7.4 的培养基中，混匀后制成平板，点种细菌，适温培养 7 d。 如在菌落周围有不透明白色沉淀区出现，表示吐温 80 被水解，为阳性反应。在此条件下，吐温 80 能水解，为阳性反应。4.8其它生理生化试验.精品文档氧化酶试验 在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加 34 滴 1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长 24 h 的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在 10 s 内变成紫色，为阳性反应；在 60 s 以后变色或一直

13、不变色，为阴性反应。在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应。过氧化氢酶（接触酶）试验 挑取在固体培养基上生长 2448 h 的菌苔，置于干净玻片上，滴加 3%的过氧化氢，30 s 内有大量气泡产生为阳性，不产气泡为阴性。在此条件下，菌苔过氧化氢酶试验为阳性。4.9致病性测定烟草过敏性反应将在 26条 件下，培养 72 d 的菌株，用无菌水配成 3× 108 /ml 的菌液，对烟草下表皮进行皮下接种，在 24 条 件下经 20 24 h 后检查是否出现过敏性坏死斑。植株致病性测定将分离菌株接种在植株健叶或休眠枝条上，菌液浓度 6×108 /ml。1015 d 后或次年 2 月

14、下旬到 3 月下旬，检查是否出现典型叶斑症状，具晕圈；休眠枝条有溃疡症状及菌浓。根据上述检验结果，对照病原特征（附录 2），鉴定是否为猕猴桃溃疡病菌 Pseudomonas syringae pv. actinidiae Taki kawa et al.5 除害处理5.1禁止从疫情发生区调运染疫植物活体。5.2 发现带疫植株应喷洒 1 万单位农用链霉素 3000 倍液、30%琥珀酸铜（DT）胶悬剂 200 倍液或 70% 百菌通 500 倍液分 23 次进行处理。附录 1猕猴桃细菌性溃疡病菌的分离鉴定方法1、病原鉴定根据叶片上的水渍状晕圈和枝干上白色水滴状菌脓初步诊断为细菌性病害。取病健交界处

15、组织一块，放于载玻片上，向小块上滴 12 滴无菌水或蒸馏水，加盖玻片后。立即用低倍显微镜观察水滴与组织交界处，见到云雾状菌溢，亦可证明组织内有细菌存在。2、病原分离新鲜病健交界处的病组织洗净后切成 4 mm×4 mm 小块，用灭菌水冲洗 3 次；分别用 70酒精和 0.51的次氯酸钠进行表面消毒，病组织在消毒液中浸泡 12 min，再用无菌水冲洗 3 次，按下列方法进行分离。培养皿稀释分离法：取灭菌后的培养皿 34 个，每皿加灭菌水 0.5 m1，将.精品文档经表面消毒并充分冲洗的病组织小块移至第一皿的水滴中，用灭菌玻璃棒碾碎，静置 30 分钟左右，是组织内细菌流入水中，配成悬浮液。

16、用灭菌后的接种环从第一皿内移植 23 环至第二皿内并充分、混合后再移植到第三皿，依次稀释到最后一皿。将熔化的琼脂培养基冷却至 45 左右，倒入每个皿中，在培养基未凝固前，轻转动培养皿，使培养基与菌悬液混匀，冷却后将培养皿翻转，置 2530 下培养。平板划线培养法：将上述的病组织放在灭菌载玻片上的一滴灭菌水中，玻棒搅碎，静置一段时间，用灭菌的接种环在普通培养基或选择性培养基上划线培养。培养基可选用：肉汁胨琼脂培养基（BPA）：牛肉浸膏3.0 g蛋白胨510 g蔗糖10.0 g酵母膏1.0 g琼脂17.0 g蒸馏水1000 mlpH7.0培养性状：菌落圆形，污白色，全缘，微凹，光滑，生长缓慢，直径

17、约 1 3 mm。蔗糖蛋白胨培养基（SPA）：蔗糖3.0 g蛋白胨5.0 gK2HPO40.5 gMgSO4?7H2O0.25 g琼脂17.0 g蒸馏水1000 mlpH7.27.4培养性状：菌落呈粘稠状。金氏 B 培养基（K BA ）：甘油10.0 g膘蛋白胨（ proteosepeptone）20.0 gK2HPO41.5 gMgSO4?7H2O1.5 g琼脂（水洗）17.0 g蒸馏水1000 mlpH7.2培养性状：有黄绿色荧光。3、致病性测定.精品文档应选择未成熟的及正在迅速生长的植物的新梢、新叶进行；尽可能模拟自然侵染方式接种寄主。将培养 24 72 h 的单胞菌落制成菌悬液，浓度为

18、 3×108 CFU/ml ，进一步稀释到 104107 CFU/ml ，用针刺法或涂抺伤口法对猕猴桃离体枝叶或幼苗、新枝等进行接种，温度为 15 左右，保湿 48 h，710 d 后观察，如表现明显症状，证明所分离的单胞菌落为植物寄生细菌，可进一步做细菌学和生理生化性状的观察试验，以鉴定细菌的种类。如分离所得菌株过多，可采取烟草过敏反应（HR）以快速测定分离物的致病性。方法是配制 107108 CFU/ml 的菌悬液，用注射针将菌液从烟草下表皮注入叶肉组织间。烟草植株应保持在 25 ，相对湿 度 85%，日照 16 h 条件下，在 2448 h 表现枯斑的为阳性反应，3 d 后出现黄斑的为阴性反应。HR 测定是 LOPAT 试验的测定项目之一，对于荧光假单胞菌的鉴定很有意义。猕猴桃细菌性溃疡病的 HR 为阳性。4、形态特征观察细菌的