(动物来源)碱性磷酸酶的提取及性质研究

1、（动物来源）碱性磷酸酶（动物来源）碱性磷酸酶的提取及性质研究的提取及性质研究 主要内容主要内容 课题研究现状课题研究现状 研究方案研究方案 实验器材及试剂配置方法实验器材及试剂配置方法课题研究现状课题研究现状 碱性磷酸酶(简称ALP或AKP) 是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于植物、动物和微生物体内，是一种重要的调控酶，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程。 目前，国内外学者对 ALP 进行了广泛的研究，包括不同物种 ALP 的结构、催化反应机理、理化性质、分离纯化、功能基团、检测方法等。课题研究现状课题研究现状 迄今为止，有大量关于碱性磷酸酶的报道，在1911年Levene

2、等、1912年Grosser等就已经分离到(碱性)憐酸酯酶；直到1934年，Davis正式提出了碱性磷酸酶这一命名；1958年，Agren等运用同位素标记的方法分离到磷酸丝氨酸;近些年以来,很多研究者从不同动物组织中分离纯化出了碱性憐酸酶，并对其部分性质做了大量的研究。研究方案研究方案1.碱性磷酸酶的分离纯化碱性磷酸酶的分离纯化2.分子量测定（分子量测定（SDSPAGE）原理）原理 3.Km和和Vmax值测定值测定4.酶的固定化酶的固定化5.酶动力学研究酶动力学研究初步纯化原理初步纯化原理 采取有机溶剂沉淀法从猪肝匀浆液中提取、采取有机溶剂沉淀法从猪肝匀浆液中提取、分离碱性磷酸酶分离碱性磷酸酶

3、(AKP)。正丁醇能使部分杂。正丁醇能使部分杂蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有蛋白变性，过滤除去杂蛋白即为含有 AKP 的滤液，的滤液，AKP 能溶于终浓度为能溶于终浓度为 33的丙酮的丙酮或或30的乙醇中，而不溶于终浓度为的乙醇中，而不溶于终浓度为50的丙酮或的丙酮或 60的乙醇中，通过离心即可得的乙醇中，通过离心即可得到初步纯化的到初步纯化的 AKP。 分离纯化试剂分离纯化试剂 （1）0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml（2）0.01mol/L醋酸镁-0.0lmol/L醋酸钠溶液:准确吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶100ml0.14mol/

4、L醋酸钠溶液，混合后定容至1000ml（3）正丁醇、丙酮、乙醇（4）Tris-HCl ph8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/LTris溶液.取100ml 10.1mol/LTris溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L醋酸镁溶液100ml，混匀后用1%冰醋酸调ph为8.8，用蒸馏水定容至1000ml；碱性磷酸酶的分离纯化碱性磷酸酶的分离纯化 取新鲜猪肝取新鲜猪肝20g20g剪碎（剪碎（0-40-4），加），加0.01mol/L0.01mol/L醋醋酸镁酸镁0.0lmol/L0.0lmol/L醋酸钠醋酸钠60ml60ml，

5、在电动匀浆机上匀，在电动匀浆机上匀浆，称为浆，称为A A液液 除去杂蛋白除去杂蛋白 在在A A液中加液中加10ml10ml正丁醇，用玻璃棒正丁醇，用玻璃棒搅拌搅拌3-53-5分钟后，室温放置分钟后，室温放置20min40min20min40min。四层纱。四层纱布过滤后，离心布过滤后，离心30min30min，2500r/min2500r/min，取上清液，取上清液，放入干燥洁净离心管放入干燥洁净离心管1 1 除去脂肪除去脂肪 在离心管在离心管1 1中加等体积的冷丙酮（中加等体积的冷丙酮（- -1010）混匀，冰冻离心）混匀，冰冻离心5 5分钟（分钟（25002500转），弃去上转），弃去上清

6、液，在沉淀中加清液，在沉淀中加0.5moL/l0.5moL/l醋酸镁醋酸镁20ml20ml，充分搅，充分搅拌使其变成悬浊液，记录体积，称为拌使其变成悬浊液，记录体积，称为B B液液碱性磷酸酶的分离纯化碱性磷酸酶的分离纯化 在在B液中加液中加95%的冷乙醇，使乙醇最终浓度达的冷乙醇，使乙醇最终浓度达到到30%，混匀后立即离心，混匀后立即离心5min，量取上清液，倒，量取上清液，倒入另一干燥洁净的刻度离心管入另一干燥洁净的刻度离心管2中，记录溶液体中，记录溶液体积，弃去沉淀。积，弃去沉淀。 在离心管在离心管2中加入冷中加入冷95%的乙醇，使乙醇最终浓的乙醇，使乙醇最终浓度达到度达到60%，混匀后离

7、心，混匀后离心5min，弃去上清液，留，弃去上清液，留下沉淀。下沉淀。 向沉淀中加入向沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁溶液醋酸镁溶液10mL，充分，充分溶解，向沉淀中逐滴加入冷丙酮至丙酮的最终浓溶解，向沉淀中逐滴加入冷丙酮至丙酮的最终浓度达到度达到33%，离心，离心5min，取上清液，取上清液 ，放入干燥，放入干燥洁净的离心管洁净的离心管3中中 向向3中加冷丙酮，直至丙酮的最终浓度为中加冷丙酮，直至丙酮的最终浓度为60%，混匀后离心混匀后离心5min，弃去上清液，留下沉淀，该沉，弃去上清液，留下沉淀，该沉淀即为部分纯化的碱性磷酸酶。向沉淀中加入淀即为部分纯化的碱性磷酸酶。向沉淀中加入PH8.8

8、的的Tris缓冲液缓冲液10mL，使其溶解，称为，使其溶解，称为C液。液。分子量测定（分子量测定（SDSPAGE）原理）原理 SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了物都带上相同密度的负电荷，其

9、数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，根据标准蛋白质分只取决于分子大小这一因素，根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。知物的分子量。电泳试剂电泳试剂 （1）分离胶缓冲液(A 液，3.0mol/L TrisHCl 缓冲液， pH8.9)：1mol/L HCl 48mL，加Tris 36.3g，重蒸水定容至100mL，调至pH8.9 （2）30% 丙烯酰胺(B 液)： Acr(丙烯酰胺)30g，Bis(N，N亚甲基双丙烯酰胺)0.8g，

10、加重蒸水定容到100mL （3）浓缩胶缓冲液(C 液，0.5mol/LTrisHCl缓冲液，pH6.7)：1mol HCl 48mL，Tris 5.98g加重蒸水定容到100mL调pH至6.7 （4）TEMED(四甲基乙二胺，T液)（5）10% SDS ( S液) （6）10%过硫酸铵：1g过硫酸铵，加重蒸水10mL，最好临用前配制 （7）pH8.3 电极缓冲液：Tris 6.05g，甘氨酸 28.8g，10% SDS 10mL加重蒸水溶解，调pH到8.3，定容至1000mL，用时10倍稀释 （8）染色：取考马斯亮蓝R250，0.46g溶于400mL脱色液中，过滤后备用 （9）脱色液：80mL

11、冰醋酸，250mL 95%乙醇，加蒸馏水定容至1000mL分子量测定分子量测定SDS-PAGE电泳：电泳：（采用7. 5%分离胶 3%的浓缩胶对酶蛋白进行分离鉴定）（1）安装双垂直板电泳槽；）安装双垂直板电泳槽； （2）配）配12%的分离胶的分离胶5 mL，浓缩胶，浓缩胶3 mL；（3）制样：取样品）制样：取样品20 L与样品缓冲液与样品缓冲液10 L混合，混合，100 加热加热5分钟；分钟；（4）上样：用微量注射器加样）上样：用微量注射器加样15-20 L（5）电泳：在凝胶上加）电泳：在凝胶上加40 V/cm电压，待染料进入分离胶电压，待染料进入分离胶后将电压提高到后将电压提高到140 V/

12、cm继续电泳直到染料到达底部；继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几染色液浸泡，加热几分钟；分钟；（7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板次，直到胶板呈现淡蓝色。呈现淡蓝色。Km值测定试剂值测定试剂（1）0.04mol/L底物液（磷酸苯二钠）：称取10.16g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na22H2O），用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至1，000ml，加4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。（2）0.1mol/l碳酸盐缓冲液（ph10.0）：称取无水碳酸钠6

13、.36g及碳酸氢钠3.36g溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml；（3）0.5mol/LNaOH（4）0.3%4-氨基安替比林:称取3g4-氨替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存（5）0.5%铁氰化钾：称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存；Km和和Vmax值测定值测定Km和和Vmax值测定值测定 按表1操作加入酶液混匀之后立即计时，各管在37水浴中准确保温15分钟后，立即加入0.5mol/LNaOH溶液1.0ml终止反应； 显色，各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0

14、ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，静置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管吸光度。作图，所测各管的吸光度代表各管中反应速度V，以之为纵轴，以作用物浓度S为横轴作图观察曲线形状；以各管吸光度值的倒数为纵坐标，以作用物浓度的倒数为横坐标作图求酶的Km值。酶的固定化原理酶的固定化原理 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。称为固定化酶。 酶的固定化酶的固定化 与游离酶相比，固定化酶

15、有以下优点：与游离酶相比，固定化酶有以下优点： 提高酶的稳定性 易与产物分离 可反复利用 酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。 酶的固定化方法有：酶的固定化方法有： 吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。酶的固定化酶的固定化（1）称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。（2）称取8 g NaOH置大烧杯中，加入180 mL蒸馏水及20 mL甲醇。（3）将拔出推塞的注射器架在铁架台上，倒入粘稠状的壳聚糖溶液，使壳聚糖溶液从20 cm高的注射器出口滴入大烧杯中，以制备壳聚糖微球载体。（4）壳聚糖溶液滴加完毕

16、后，静止片刻，待微球完全沉入烧杯底部时，反复水洗多次至pH值中性，沥干水分。加入1%戊二醛溶液100 mL，静置2 h，使戊二醛偶联于壳聚糖载体上。注意：为保证适宜的流速，注射器中的壳聚糖溶液不宜超过10 mL，随着壳聚糖溶液逐滴滴入大烧杯，应随时补充壳聚糖溶液至刻度，并不断轻轻晃动大烧杯。若液体表面壳聚糖微球过于密集，应静置片刻，待微球沉入烧杯底部后继续滴加。固定化酶的制备固定化酶的制备 1、将静置2 h后的壳聚糖微球载体中的戊二醛溶液倒掉，再用蒸馏水洗涤5次，以除去多余的戊二醛。 2、将实验纯化得到的碱性磷酸酶液1 mL用蒸馏水稀释至100 mL，与偶联戊二醛的壳聚糖载体混合，静置偶联过夜。 3、固定化酶测定前，用蒸馏水洗涤两次，以除去未固定住的残留酶液.（洗涤液并入残留液 酶动力学研究酶动力学研究最适最适pH及酸碱稳定性实验及酸碱稳定性实验最适温度及热稳定性实验最适温度及热稳定性实验抑制剂类型鉴别抑制剂类型鉴别酶动力学研究试剂酶动力学研究试剂 （1）各pH值相应缓冲液（2）基质液：称取磷酸苯二钠2H2O 6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却后的蒸馏水中，两