多肽药物的含量测定方法

1、肽类药物的含量测定方法肽类药物的含量测定方法背景：背景：多肽类药物及其主要优势人体多肽类药物及其主要优势人体的生长和发育都离不开多肽，多肽是调节的生长和发育都离不开多肽，多肽是调节系统功能系统功能和和细胞生长的基础。多肽类药物作为药物开发的主要方向，细胞生长的基础。多肽类药物作为药物开发的主要方向，它包括它包括多种类型，常见的多多种类型，常见的多肽类药物有如下肽类药物有如下几种几种 .多肽类疫苗：多肽类疫苗的研制为人类攻克肝炎、艾滋病多肽类疫苗：多肽类疫苗的研制为人类攻克肝炎、艾滋病等疾病带来了希望。等疾病带来了希望。 .抗肿瘤多肽类药物：肿瘤危害人类的生存，其产生是多方抗肿瘤多肽类药物：肿瘤

2、危害人类的生存，其产生是多方面因素共同作用的结果，但归根到底是癌基因表达的问题。面因素共同作用的结果，但归根到底是癌基因表达的问题。多肽类抗癌药物由于其能够多肽类抗癌药物由于其能够成为肿瘤成为肿瘤基因表达基因表达时的调控因子，因而成为了抗癌药物研究的新希望时的调控因子，因而成为了抗癌药物研究的新希望。 .抗病毒类多肽药物：一般来说，病毒感染细胞的过程包括以下几个主要阶段：吸抗病毒类多肽药物：一般来说，病毒感染细胞的过程包括以下几个主要阶段：吸附、自我复制、重新组合、释放病毒等。抗病毒多肽通常作用于病毒吸附和病毒复制附、自我复制、重新组合、释放病毒等。抗病毒多肽通常作用于病毒吸附和病毒复制两个阶

3、段，通过与宿主细胞特异性结合或者病毒蛋白酶结合来发挥作用。两个阶段，通过与宿主细胞特异性结合或者病毒蛋白酶结合来发挥作用。一一 、酸碱滴定法酸碱滴定法示例：苯示例：苯酪酪酞的测定酞的测定测定方法：取本品约0.5g精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液呈中性）60ml，振摇，溶解后加酚酞指示液数滴，用氢氧化钠滴定（0.1mol/L)，即可。二二、 紫外分度光度法紫外分度光度法 示例：五肽胃泌素含量测定示例：五肽胃泌素含量测定五肽胃泌素为白色或类白色粉末。五肽胃泌素为白色或类白色粉末。本品能促进胃酸、胃蛋白酶及内因本品能促进胃酸、胃蛋白酶及内因子的分泌，其促胃酸分泌作用相当子的分泌，其促胃酸分泌作用相

4、当于内源性胃泌素的于内源性胃泌素的1/4，作用可持续，作用可持续1040分钟。临床上主要用于胃酸分分钟。临床上主要用于胃酸分泌机能的检查泌机能的检查。方法原理：方法原理： 供试品加供试品加0.01mol/L氨溶液定量稀释，制成供试液，置紫氨溶液定量稀释，制成供试液，置紫外可见分光光度计外可见分光光度计,于于280nm波长处测定吸收度，计算出其含量。波长处测定吸收度，计算出其含量。 试剂：试剂： 氨溶液（氨溶液（0.01mol/L） 标准品：标准品：E1%1cm 为为70计算计算仪器设备：仪器设备： 紫外可见分光光度计紫外可见分光光度计注：分光光度法应以配制供试品的同批溶剂为对照，采用注：分光光

5、度法应以配制供试品的同批溶剂为对照，采用1cm的石英吸收池。的石英吸收池。以吸收度最大的波长作为测定波长，一般供试品的吸收度读数，以在以吸收度最大的波长作为测定波长，一般供试品的吸收度读数，以在0.3-0.7之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则之间的误差较小。仪器的狭缝波带宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸收度偏低。狭缝宽度的选择，应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度测得的吸收度偏低。狭缝宽度的选择，应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品的不再增加为准。由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试

6、品的吸收度后应减去空白读数，再计算含量。吸收度后应减去空白读数，再计算含量。三、效价测定法三、效价测定法实例（实例（1）：抑肽酶效价的测定）：抑肽酶效价的测定抑肽酶抑肽酶(Trasylol，别名：抑胰肽酶、屈来密多，别名：抑胰肽酶、屈来密多) 能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。临床用于预防和止胰脏中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。临床用于预防和治疗急性胰腺炎、纤维蛋白溶解引起的出血及弥漫性血管内凝血。还可用于抗治疗急性胰腺炎、纤维蛋白溶解引起的出血及弥漫性血管内凝血。还可用于抗休克治疗。在腹腔手术后，直接

7、注入腹腔可预防肠休克治疗。在腹腔手术后，直接注入腹腔可预防肠粘连。粘连。抑肽酶通过酶上的丝氨酸活性部分，形成抑肽酶抑肽酶通过酶上的丝氨酸活性部分，形成抑肽酶-蛋白酶复合物而达到抑制作蛋白酶复合物而达到抑制作用。然而与不同的蛋白酶结合，显示出不同的离解常数。与胰蛋白酶的结合最用。然而与不同的蛋白酶结合，显示出不同的离解常数。与胰蛋白酶的结合最牢固与人体纤溶酶的结合不很牢固。牢固与人体纤溶酶的结合不很牢固。（1）底物）底物溶液的溶液的制备制备 (2) 胰蛋白酶胰蛋白酶稀释溶液的制备稀释溶液的制备精密量取胰蛋白酶溶液精密量取胰蛋白酶溶液1ml，用硼砂氯化钙缓冲液（，用硼砂氯化钙缓冲液（pH 8.0）

8、稀释成）稀释成20ml，室温，室温放置放置10min，置于冰浴中。置于冰浴中。取取N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐精氨酸乙酯盐酸盐171.3mg，加水溶解并稀释至，加水溶解并稀释至25ml。临用时配制。胰蛋白。临用时配制。胰蛋白酶溶液的酶溶液的 制备制备 取胰蛋白酶对照品适量，精密称定，加盐酸滴定液（取胰蛋白酶对照品适量，精密称定，加盐酸滴定液（0.001mol/L）溶）溶解并制成每解并制成每1ml中约含中约含0.8单位（每单位（每1ml中约含中约含1mg）的溶液，临用时配制并置于冰浴中。）的溶液，临用时配制并置于冰浴中。(3) 供供试品溶液的制备试品溶液的制备取本品适量，精密称定，加硼

9、砂一氯化钙缓冲液（取本品适量，精密称定，加硼砂一氯化钙缓冲液（pH 8.0）溶解并制成每）溶解并制成每1ml中约含中约含1.67单位（每单位（每1ml中约含中约含0.6mg）的溶液，精密量取）的溶液，精密量取0.5ml与胰蛋白酶溶液与胰蛋白酶溶液2ml，再用硼砂，再用硼砂一氯化钙缓冲液（一氯化钙缓冲液（pH 8.0）稀释成）稀释成20ml，反应，反应10分钟，置冰浴中（分钟，置冰浴中（2小时内使用）。小时内使用）。(4) 测定测定法法取硼砂氯化钙缓冲液（取硼砂氯化钙缓冲液（pH 8.0）9.0ml与底物溶液与底物溶液1.0ml，置，置25ml烧杯中，于烧杯中，于250.5恒温水浴恒温水浴中放置

10、中放置35分钟，在搅拌下滴加氢氧化钠滴定液（分钟，在搅拌下滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节）调节pH值为值为8.0，精密加入供试品溶液，精密加入供试品溶液（经（经25保温保温35分钟）分钟）1ml，并立即计时，用，并立即计时，用1ml微量滴定管以氢氧化钠滴定液（微量滴定管以氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定）滴定释放出的酸，使溶液的释放出的酸，使溶液的pH值始终保持在值始终保持在7.98.1。每隔。每隔60秒读取秒读取pH值恰为值恰为8.0时所消耗的氢氧化钠时所消耗的氢氧化钠滴定液（滴定液（0.1mol/L）的体积（）的体积（ml），共），共6分钟。另精密量取胰蛋白酶稀释溶液分钟

11、。另精密量取胰蛋白酶稀释溶液1ml，按上法操作，作，按上法操作，作为对照（重复一次）。以时间为横坐标，消耗的氢氧化钠滴定液（为对照（重复一次）。以时间为横坐标，消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）为纵坐标作图，应为）为纵坐标作图，应为一条直线。供试品和对照两条直线应基本重合，求出每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（一条直线。供试品和对照两条直线应基本重合，求出每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体）的体积（积（ml），按下式计算。），按下式计算。每每1mg抑肽酶的效价（单位抑肽酶的效价（单位）式中式中 4000为系数；为系数；W为抑肽酶制成每为抑肽酶制成每1ml中约含中约含1.67单位时的

12、酶量，单位时的酶量，mg；n1为对照测定时每秒钟消耗的氢氧化钠滴定液（为对照测定时每秒钟消耗的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体积，）的体积，ml；n2为供试品溶液每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（为供试品溶液每秒钟消耗氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的体积，）的体积，ml；2为供试品溶液中所加入胰蛋白酶的量为对照测定时的为供试品溶液中所加入胰蛋白酶的量为对照测定时的2倍；倍；f为氢氧化钠滴定液（为氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）校正因子。）校正因子。效价单位定义效价单位定义能能抑制一个胰蛋白酶单位抑制一个胰蛋白酶单位每秒钟能水解每秒钟能水解1mol的的N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸乙酯（精氨酸

13、乙酯（BAEE）为一个胰）为一个胰蛋白酶单位（蛋白酶单位（microkatal）的活力称为一个抑肽酶活力单位（的活力称为一个抑肽酶活力单位（EPU）。每）。每1EPU的抑肽酶相当的抑肽酶相当于于1800KIU。注意注意事项：事项：（1）本实验测定原理：在一定条件下（）本实验测定原理：在一定条件下（pH8.0，25），胰蛋白酶可使），胰蛋白酶可使N-苯苯甲酰甲酰-L-精氨酸乙精氨酸乙酯水解为酯水解为N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸，使溶液精氨酸，使溶液pH下降，当加入氢氧化下降，当加入氢氧化钠滴定后，使溶液钠滴定后，使溶液pH又回到又回到8.0，水解继续进行。，水解继续进行。（2）当胰蛋白酶中加入抑

14、肽酶后，使）当胰蛋白酶中加入抑肽酶后，使50%的胰蛋白酶活性被抑制，剩余的胰的胰蛋白酶活性被抑制，剩余的胰蛋白酶继续与底物进行水解反应，用氢氧化钠滴定释放出的酸，使蛋白酶继续与底物进行水解反应，用氢氧化钠滴定释放出的酸，使pH始终维始终维持持7.98.0，在一定时间内，根据根据样品消耗的氢氧化钠（，在一定时间内，根据根据样品消耗的氢氧化钠（0.1mol/L）的体）的体积（积（ml)算出活力单位。算出活力单位。实例（实例（2）杆菌肽效价测定：）杆菌肽效价测定： 利用杆菌肽能够抑制微生物生长特性，进行实验设计。通过与标利用杆菌肽能够抑制微生物生长特性，进行实验设计。通过与标准品对微生物产生抑菌圈面

15、积的大小，从而得到待测样品相对与标准品对微生物产生抑菌圈面积的大小，从而得到待测样品相对与标准品的效价准品的效价实例（实例（3）缩宫素的效价测定）缩宫素的效价测定 利用缩宫素的能够改变小鼠子宫的收缩程度，来进行实验设计。通利用缩宫素的能够改变小鼠子宫的收缩程度，来进行实验设计。通过与标准品对子宫收缩程度进行比较，从而得到该药物相对于标准品过与标准品对子宫收缩程度进行比较，从而得到该药物相对于标准品的效价。的效价。总结：总结： 在进行多肽药物含量进行测定时可以采用了两种形式：在进行多肽药物含量进行测定时可以采用了两种形式： 第一种属于比较精准的定量第一种属于比较精准的定量如酸碱滴定法和紫外分光光

16、度法。这两种方法都是利用如酸碱滴定法和紫外分光光度法。这两种方法都是利用多肽分子结构上的特点。方法一利用游离的氨基或羧基，使多肽表现出酸碱性，可以利用低多肽分子结构上的特点。方法一利用游离的氨基或羧基，使多肽表现出酸碱性，可以利用低浓度酸或碱进行滴定；方法二利用某些特性的官能团来进行定量。因此再要进行对某种多肽浓度酸或碱进行滴定；方法二利用某些特性的官能团来进行定量。因此再要进行对某种多肽物质进行定量时，可以从结构特性下手，利用特性化学反应或者物理特性进行定量。物质进行定量时，可以从结构特性下手，利用特性化学反应或者物理特性进行定量。 第二种属于一种比较抽象的定量方式第二种属于一种比较抽象的定量方式效价测定。跟酶活力单位类似是一个可以随人为效价测定。跟酶活力单位类似是一个可以随人为规定变化而变化的，但通过规定统一标准，具有可比性。在效价测定的实例中，可以得出它规定变