发酵工程资料

1、1、微生物工程：也称发酵工程，它是指利用微生物生长繁殖与代谢活动，通过现代工程技术手段进行工业规模来生产人们所需产品的理论和工程技术体系。是生物工程和生物技术学科的重要组成部分。2、工业发酵步骤和工艺流程(1) 用作培养菌种及扩大生产的发酵罐的各种培养基的配制(2) 培养基、发酵罐以及辅助设备的消毒灭菌(3) 将培养好的有活性的适量纯种以一定比例转接到发酵罐中(4) 控制最适的发酵条件使微生物生长并形成大量代谢产物(5) 将产物抽提并进精制，以得到合格的产品(6) 回收或处理发酵过程中产生的废物和废水新种分离与筛选的步骤：确定方案样品采集样品的预处理目的菌富集培养菌种分离菌种初筛菌种复筛菌种发

2、酵性能鉴定菌种保藏（1）确定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。（2）样品采集：有针对性地采集样品。两个原则：样品的来源广泛，获得新的菌种的可能性越大；要了解目标产物的性质和可能产生目标产物的微生物及其生理性，这样就能提高效率，事半功倍。 （3）样品预处理：对样品进行预处理可提高菌种分离的效率。方法有：物理方法：包括热处理、膜过滤法和离心法化学方法：通过在培养基中添加某些化学成分来增加特定微生物的数量。诱饵法：将一些固定物质，如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到待分离的土壤或水中做成诱饵富集目的菌。（4）目的菌富集培养：主要利用不同种类的微生物其生长繁殖对环境和营养的要求不同，使目的微

3、生物在最是条件下迅速地生长繁殖，数量增加，成为优势种。控制培养基的营养成分，如唯一碳源或氮源；控制培养条件：（5）菌种分离：利用微生物菌种分离技术得到纯种。平板划线分离法稀释分离法简单平板分离法涂布分离法毛细管分离法小滴分离法（6）初筛：从分离得到的大量微生物中将具有目的产物合成能力的微生物筛选出来的过程。平板筛选：用水解圈、变色圈、抑菌圈、透明圈等方法药瓶发酵筛选：菌株摇床培养后，过滤发酵液进行活力测定。（7）复筛：进一步鉴定菌株生产能力，采用摇瓶培养，一般一个菌株重复3-5瓶，培养后的发酵液采用精确的分析方法测定。（8）发酵性能鉴定：将复筛得到的菌株进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养

4、特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。（9）菌种保藏（二）增殖培养增殖培养（也称富集培养、施加选择性压力分离法）：就是利用不同种类的微生物在生长繁殖时对环境和营养条件要求不同（温度、湿度、pH、渗透压、氧、碳源、氮源等），人为控制这些条件，使之有利于某一类或一种微生物生长而不利于其他微生物生长，使所需微生物在增殖后在数量上占优势而便于分离，其他微生物几乎不增殖或增殖缓慢，从而达到快速分离纯化的方法。增殖培养即选择培养基和控制培养条件。（三）培养分离纯种分离的方法：划线分离法、稀释分离法。快速分离方法(3种)：目的微生物

5、不纯，需分离纯化。采用简便迅速，有一定准确性的检出方法，以提高筛选效率。常用平皿反应法：纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。1. 变色圈：直接用显色剂或指示剂。在菌体筛选中直接用显色剂或指示剂掺入培养基中或喷洒已生长的菌落的培养基表面，由于培养基中所筛选出的微生物产生酸或碱性物质从而使培养基的pH值降低或升高，由于显色剂在不同pH值条件下显色不同，从而形成围绕菌落周围的变了颜色的圈叫变色圈。2. 透明圈：混浊底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸钙等。在固体培养基中加入酶作用的底物或其他物质（都能使培养基产生浑浊）培养微生物，能够利用此底物的酶的产生菌得以生长或微生物能利用此种物质，则在其菌落

6、周围形成一个透明的圈，叫透明圈，也叫水解圈。3. 生长圈：利用某些具有特殊营养要求的微生物为工具菌（如营养缺陷型菌株）若分离的微生物能在一般的培养条件下（缺乏上述营养要求的物质）生长而合成该物质，则能使工具菌生长，则在分离的微生物的菌落周围形成工具菌的生长圈，这种圈叫生长圈。4.抑菌圈：有害菌与能够产生抑菌物质的微生物菌种一起在固体培养基上进行培养时，则在产生抑菌物质的微生物菌落周围产生一个透明的圈（即有害微生物不能生长的形成的圈）叫抑菌圈。培养基：是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。发酵生产中培养基的类型：（1）孢子培养基（斜面培养基）:

7、是供微生物细胞生长繁殖或保藏菌种。包括细菌、酵母等的斜面培养基，霉菌、放线菌的产孢培养基等。特点是富含有机氮源。但放线菌或霉菌的产孢培养基的氮源和碳源不宜太丰富，否则容易长菌丝而较少产孢子。此外，还宜加少量无机盐类。（2）种子培养基： 有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和必需的生长因子。由于培养时间短，各物质浓度不需太高。为缩短发酵阶段的适应期，还应该考虑与发酵培养基的主要成分相近。（3）发酵培养基： 必须要根据菌体自身生长规律、产物合成的特点来设计。二、发酵培养基的优化1、根据以前的经验以及在培养基成分确定时必须考虑的一些问题初步确定可能的培养基成分首先要做好调查研究工作，了解菌种

8、的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。即要参照微生物细胞内元素的比例确定培养基的成分和比例。其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提炼方法和产品性质要求等也要有所了解，以便在选择培养基时心中有数。根据前人的经验和培养基成分确定时一些必须考虑的因素，初步确定可能的培养基成分。 2、通过单因子优化实验确定较适宜的培养基成分及浓度；注意培养过程中pH的变化，观察适于菌种生长繁殖和适于代谢产物形成的两种不同pH，不断调整配比来适应上述各种情况和要求，注意每次只限一个变动条件。3、金属及非金属离子的确定：也是通过单因子试验。4、最后通过多因子实验，进

9、一步优化培养基各成分最适浓度。前体：指一些添加到培养基中的物质，它们并不促进微生物的生长，但能直接通过微生物的生物合成过程结合到产物分子上去，自身结构基本不变，而产物产量却因此有较大提高。（三）酶合成的调节是指酶在数量上和种类上的调节。有两种方式：酶合成的诱导和酶合成的阻遏酶合成的诱导：凡能促进酶生物合成的现象，称为诱导。有组成酶和诱导酶。组成酶是细胞固有的酶，其合成是在相应的基因控制下进行的，它不因分解底物或其结构类似物存在而受影响。不论在什么培养基上生长都有相当的浓度。诱导酶是细胞为适应外来底物或其结构类似是、物而临时合成的一类酶。一般情况下不合成，只有在其底物或结构类似物存在时才合成。能

10、促进诱导酶产生的物质称为诱导物，它可以是该酶的底物，也可以是底物类似物或底物前体物质。诱导的作用：使微生物增强了对环境的适应能力，对于酶 本身来说，需要时合成，不需要时就不合成，避免了合成原料和能量的浪费。酶合成的诱导类型：A 同时诱导：即当诱导物加入后，微生物能同时或几乎同时诱导几种酶的合成，它主要存在于短的代谢途径中。B 顺序诱导：即先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。酶合成的阻遏：凡能阻碍酶生物合成的现象，称为阻遏。分末端产物反馈阻遏和分解代谢物阻遏。末端产物反馈阻遏（又称为葡萄糖效应）：由于某种代谢途径末端产物过量积累而阻止整个代谢途

11、径酶合成的现象。分解代谢物阻遏：指细胞内同时有两种分解底物（两种碳源或两种氮源）存在时，利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的那种底物的有关酶合成的现象。特点：与调节酶活性反馈抑制等相比，它通过调节酶合成（即产酶量）实现代谢调节，是较间接而缓慢的调节方式。优点：则是通过阻止酶的过量合成，有利于节约生物合成的原料和能量。在正常代谢途径中，酶活性调节和酶合成调节两者（关系）是同时存在且密切配合、协调进行的。酶活性的调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或 分子结构的改变来调节其催化反应的速率。影响因素底物和产物的性质和浓度；环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等)；其他的酶的存在。调节方式激活已有

12、酶的活性；抑制已有酶的活性；激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了活性的现象。代谢调节的激活作用：主要是指代谢物对酶的激活。抑制：由于某些物质的存在，降低酶活性的现象。反馈抑制（feedback inhibition）：反馈抑制是指代谢的末端产物对酶(往往是代谢途径中的第一个酶)活性的抑制。不同发酵时期染菌对发酵的影响：1、种子扩大时期染菌：危害大，如发现染菌后应灭菌后弃去。2、发酵前期染菌：易使杂菌迅速繁殖，与生产菌争夺营养和氧分。因此，应迅速重新灭菌，再接种，进行从头发酵。3、发酵中期染菌：将严重干扰生产菌的代谢，影响产物的合成。因此，应做到 早发现、

13、快处理。4、发酵后期染菌：如杂菌量不太多，可继续进行发酵；如污染量大，可提前放罐。此期染菌对不同产物的影响不同：如抗生素、柠檬酸影响不大；而肌苷、肌苷酸、谷氨酸等将影响产物的产量、产物提取和产品质量染菌的检查方法显微镜检查平板划线培养检查法或斜面培养检查法肉汤培养检查法从发酵过程的异常现象判断是否染菌显微镜检查细菌用革兰氏染色，必要时进行芽孢染色和鞭毛染色，然后再显微镜下观察。霉菌、酵母菌可直接观察。优点：简单、直接，是最常用的检查杂菌的方法之一。缺点：杂菌污染要等到繁殖一定的数量才能镜检，对发酵周期较短的生产菌判断其早期污染很不利，往往需要和其他方法结合。平板划线培养检查法或斜面培养检查法先

14、将待检样品在无菌平板上理线，要所可能的污染类型分别置于37和27下进行培养，一般8h后即可观察是否染菌肉汤培养检查法将待检样品接入无菌肉汤培养基中，分别置于37和27下进行培养，随时观察微生物生长情况，并取样镜检，判断是否染菌。适于液体培养基检查。从发酵过程的异常现象判断是否染菌根据发酵过程中的溶解氧、pH、排气中CO2含量、发酵液黏度、菌体酶活力等的异常变化来判断是否染菌。杂菌污染途径及预防（一）种子带菌的原因及防止（1）培养基及用具灭菌不彻底 原因：菌种培养基及用具灭菌均在杀菌锅中进行，造成灭菌不彻底的原因是灭菌锅内空气排放不完全，造成假压，使灭菌时温度达不到要求。防止方法：灭菌时锅内排气

15、完全（2）菌种在移接过程中受污染原因：当菌种移接操作不当，或无菌室管理不严，就可能引起污染防止方法：合理设计无菌室，严格无菌室管理制度，严格无菌操作接种（3）菌种在培养过程或保藏过程中受污染原因：菌种在培养或保藏过程中，由于外界空气进入，使杂菌进入而受污染。防止：试管棉塞应有一定松紧度，不宜太松且有一定的长度；培养和保藏温度变化不宜太大；每一级种子经检查合格后才能使用。（二）无菌空气带菌及防治原因：在好氧发酵中通入的无菌空气带菌是发酵污染菌的主要原因之一。防止：空气净化流程和设备的设计要合理，过滤介质的选用和装填过滤介质的灭菌和管理等方面都要适用、有效、合理。（三）设备渗漏或设备、管道存在“死

16、角”造成的染菌及防治（1）、设备渗漏引起的染菌及防治原因：发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏，从而引起染菌。防止办法：选用优质材料，并经常进行检查。如冷却蛇管的微小渗漏不易被发现，可以压入碱性水，在可疑的地方，用浸湿的酚酞指示剂的白布擦，如有渗漏时白布即显红色。（2）、设备、管道存在“死角”造成的染菌及防治：“死角”：由于操作、设备结构、安装或人为造成的屏障等原因，引起蒸汽不能有效到达或不能充分到达预定应该达到的局部灭菌部位，从而不能达到彻底灭菌的要求。这些部位即为“死角”。“死角”可以是设备、管道的某一部位，也可以是培养基或其它物料的某一部分，如发酵罐中

17、可存在许多死角。不锈钢衬里破裂形成“死角”。发酵罐底部培养基的沉积污垢形成“死角”。管道转弯处形成“死角”。法兰连接不当造成“死角”。（四）培养基灭菌不彻底导致染菌及防治（1）、原料性状 原因：稀薄的培养基易灭菌彻底；而淀粉质原料特别是有颗粒时易灭菌不彻底或是升温过快或混合不均时，易结块，使中心部位在灭菌时“夹生”，导致在发酵过程中团块散开而染菌。 防止措施：淀粉质培养基以实罐灭菌为好，在升温时先搅拌均匀，并加入一定量的a淀粉酶进行液化，并将原料大颗粒筛去。（2） 原因：实罐灭菌时未充分排除罐内空气，此种情况造成“假压”使罐顶局部温度达不到灭菌要求，导致灭菌不彻底而污染。防止措施：在实罐灭菌升

18、温时，应打开排气阀门有关相连接管的边阀、压力表接管边阀等，使蒸汽通气达到彻底灭菌。（3） 原因：培养基连续灭菌时蒸汽压力波动大，培养基未达到灭菌温度，导致灭菌不彻底而受污染。 防止措施：培养基连续灭菌时应严格控制灭菌温度，最好采用自动控制装置。（五）操作不当造成染菌： 原因：在发酵过程中由于操作不当而引起杂菌污染：如移种时或发酵过程，罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；泡沫顶盖而造成污染；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染等等。防止措施：科学严密的管理，加强工人技术培训和责任心的教育， 提高工人的素质。（六）噬菌体染菌及防治。1、污染原因：菌种本身带噬菌体，特别是溶源性噬

19、菌体，这种菌种一经发现，应立即弃去。生产的环境中有噬菌体。2、预防措施最有效的方法是以净化环境为中心 的 综合防治法。决不使用可疑菌种。清除周围环境中存在的噬菌体。能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，消灭污染源，搞好清洁卫生工作。选育抗噬菌体菌株，使用抗噬菌体的菌种。做到种子本身不带噬菌体，轮换使用不同类型的菌体。注意通气质量。取风口应设在3040米的高空，空气过滤器要能保证无菌空气的质量。改进提高空气的净化度、保证纯种培养。改进设备、装备、消灭“死角”，药物防治等措施。四：液体培养基的灭菌（1）湿热灭菌法方法：它比干热灭菌法更有效，这一方面是由于湿热易于传递热量，另一方面是由于湿热更易破坏保持蛋白质

20、稳定性的氢键等结构，从而加速其变性。（2）实罐灭菌（分批灭菌）：将配置好的培养基置于发酵罐或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所有设备一起进行加热灭菌的操作过程。，（3）连续灭菌（又叫连消）将配制好的培养基在向发酵罐输送的同时进行加热、保温和冷却等灭菌操作的过程。五： 固体培养基的灭菌（1）固体培养基现主要采用旋转蒸煮锅（灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持2030min）进行灭菌，实现了机械化（过去手工操作）。（2）主要用于：固体曲、固体发酵原料的灭菌（3）固体培养基的特点：呈片状或粒状，不易翻动，吸水后加热易成团，冷却困难（故旋转蒸锅较适合它的特点）。（4）设备结构：旋转蒸煮锅有单头（出口）和双

21、头两种，由钢板焊制能承受一定压力，锅中心有空心横轴，轴则装在支架两端的轴承中，借齿轮转动。六：过滤除菌(1)过滤除菌是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。(2)无菌空气制备流程（对应的设备）：空气（前置空气过滤器）进行粗滤（空压机）升压（一级冷凝器）对压缩空气降温（二级甚至多级冷凝器）降温（油水分离器）除水、除油 (空气加热器)降低湿度 空气储罐稳压(空气过滤器)除菌无菌空气进入(发酵罐)一、种子扩大培养种子的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或三角瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数

22、量和质量的纯种培养过程。这些纯种的培养物称为种子。二、种子扩培的一般步骤：将砂土管或冷冻干燥管内保藏的菌种以无菌的方式接种至适合的斜面培养基上 进行活化培养。将生长良好的斜面孢子或菌丝转种到扁瓶固体培养基或药瓶液体培养基中扩大培养完成实验室种子制备。将扩大培养的孢子或菌丝体接种到一级种子罐，制备生产用种子。制备好的种子转种至发酵罐中进行发酵。三、影响种子质量的因素有：原材料质量：即用于制备种子的原材料质量。培养温度：尤其是斜面的培养温度。湿度：斜面的湿度。通气与搅拌：种子罐培养时的通气量。斜面冷藏时间：越长其生产能力下降越多。培养基：一般要碳源少些，氮源多些，有利于菌体的培养。但要进行优选和对

23、比试验确定。pH值：要适宜。以利于获得最大比生长速率和适当的菌体量，同时最后一级种子的培养基要与发酵培养基的pH值接近。四、接种龄与接种量（1）.接种龄是指种子罐中培养的菌体从开始培养到接种至下一级罐时的培养时间。最适接种龄因菌种不同而有很大的差异。一般细菌种龄为724h，霉菌为1650h，放线菌为2164h等。一般最适的种龄应通过多次试验确定。（2）.接种量指的是移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体积的比例。不同微生物不同，一般霉菌发酵接种量为10%，多数抗生素发酵接种量为7%15%等。微生物的初级代谢：初级代谢、代谢调节、代谢控制初级代谢：初级代谢作用是生命活动的最基本特征，是生物体进行一

24、切生化反应的总称。它为生物提供能量、合成中间体及其关键大分子，是生物体生长、繁殖必需的代谢。代谢调节：指微生物的代谢速度和方向按照微生物的需要而改变的一种作用。包括酶量的调节、酶活性的调节。方式包括：细胞透性的调节、代谢途径区域化、代谢流向的调控、代谢速度的调控。代谢控制：是指运用人为的方法对微生物的代谢调节进行遗传改造和条件的控制，以期按照人们的愿望，生产有用的微生物制品。二、提高初级代谢产物产量的方法1使用诱导物水解酶类大都属诱导酶类，因此向培养基中加入诱导物就会增加胞外酶的产量。2除去诱导物选育组成型产生菌3降低分解代谢产物浓度，减少阻遏的发生4解除分解代谢阻遏筛选抗分解代谢阻遏突变株5

25、解除反馈抑制筛选抗反馈抑制突变株6防止回复突变的产生和筛选负变菌株的回复突变株7、改变细胞膜的通透性8、筛选抗生素抗性突变株9、选育条件抗性突变株10、调节生长速率11、加入酶的竞争性抑制剂1、分批发酵（1）分批发酵的定义是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。（2）分批发酵的特点微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。（3）优点：操作简单；操作引起染菌的概率低；不会产生菌种老化和变异等问题。（4）缺点: 非生产时间较长、设备利用率低。生长到一定程度就要受到抑

26、制（原因：基质抑制或产物抑制）(5)分批发酵动力学分类对实践的指导意义:如果生产产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足量菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。2、补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵（fed-batch fermentation） ，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。（2）优点：使发酵系统中维持很低的基质浓度；和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；不会产生菌种老化和变异等问题。可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维

27、持适当的菌体浓度，使不致于加剧供氧的矛盾。避免培养基积累有毒代谢物。减少通风设备的压力。（3）缺点存在一定的非生产时间；和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。分批补料系统并不连续地向罐外放出发酵液，因而发酵罐内的培养基体积不再是个常数，而是随时间和物料流速而变化的变量。(4) 适用范围： 培养基成分的浓度显著影响菌体和产物得率的发酵，即减轻底物浓度的抑制作用。受到分解代谢物阻遏的发酵。营养缺陷型菌株的培养。（流加该菌株所需的物质，不至于过量而产生反馈抑制或阻遏）前体的补充。（可以避免前体对细胞的毒害）如补料分批发酵广泛应用于抗生素、氨基酸、酶蛋白、核苷酸、有机酸、色素及高聚物等

28、的生产。3、连续发酵（1）新鲜培养基料液连续输入发酵罐，并同时以相同速度放出含有产品的发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。是在开放系统中进行的。（2）优点能维持低基质浓度。可以提高设备利用率和单位时间产量。便于自动控制。恒定状态可以有效延长分批培养中的指数生长期。在恒定状态下，微生物所处环境条件，如营养物质浓度、产物浓度、pH值，以及微生物细胞浓度、比生长速率等可以始终维持不变，甚至还可以根据需要来调节生长速率。 （3）缺点 菌种发生变异的可能性较大。要求严格的无菌条件。工艺中的变

29、量较分批发酵复杂，较难控制和扩大。不适于次级代谢产物的发酵生产。工艺条件控制的目的：就是要为生产菌创造一个最适的环境，使我们所需要的代谢活动得以最充分的表达，从而生产出过量的代谢产物。发酵条件：是指影响发酵过程中各种化学及生物学反应的环境因素。主要的条件有：温度、pH值、溶氧和搅拌、泡沫、CO2及营养基质的浓度等。补料控制目的：解除基质过浓的抑制；解除产物的反馈抑制；解除葡萄糖分解代谢阻遏效应补料控制方法：恒pH法：通过pH值的变化推测菌体的生长状态，调节流加速度，使pH为恒定值。恒溶氧法：以溶氧为反馈指标，根据溶解氧的变化曲线调整碳源的流加量。菌体密度法：通过检测菌体的浓度，以及营养利用情况

30、，调整碳源的加入量。二氧化碳释放率（CER）法：通过检测CER。估计碳源的利用情况，控制营养的流加。高密度培养技术（High Cell-density Culture）是指利用一定的培养技术或装置提高菌体的密度，使菌体密度较分批培养技术有显著的提高，最终提高特定产物的比生产率的技术。特点：发酵液中菌体浓度比分批式培养可高10倍以上。发酵终点的判断（即放罐时间的判断）1、不同类型的发酵，要求达到的目的不同，因而对发酵终点的判断标准各有不同。一般终点判断标准归纳起来有两个：即产品的质量和经济效益。一般原材料成本占整个生产成本核算主要部分的发酵。主要追求提高生产率、得率（转化系数）和发酵系数。若下游

31、提取精制成本占主要部分，且产品价格比较昂贵，则除了要求高的产率和发酵系数外还要求高的产物浓度。因此，如以提高总的生产率就要缩短发酵周期，就要在产物合成速率较低时结束发酵。放罐过早、过晚都将对下阶段提取有不利的影响。因残留物对提炼有影响。2、判断放罐的主要指标有：产物浓度、过滤速度、氨基酸和残糖含量、菌丝形态、DO（溶氧）、pH值、培养液的外观、发酵液的黏度等。异常发酵的表现：发酵液转稀、发酵液过浓、消耗缓慢、pH不正常等。1、发酵液转稀：指发酵尚未进入放罐阶段，发酵液就变稀。（1）原因：感染噬菌体（2）措施：防噬菌体。未知的其它原因：可补充氮源促菌丝生长，或补充碳源也可。2、发酵液过浓：（1）

32、原因：氮源过多，菌丝生长快、浓度大，从而降低发酵液中溶解氧的浓度，影响发酵正常进行。（2）措施：补入大量的水。3、消耗缓慢：（1）原因：产生菌孢子和种子质量不好。培养基消毒不合格及其中的磷酸盐浓度下降等。（2）措施：补充合适的氮源，或磷酸盐，提高发酵温度。4、pH不正常：一般选用的发酵培养基pH都能控制在合适范围内，以保证产物合成和菌体生长。但在一些情况下导致pH异常，可通过加酸或碱调节。最好加入一些生理酸性或碱性盐或缓冲液来调节。发酵过程的参数检测的意义：ü要实施发酵过程的控制，就必须选取一些参数，并且只有通过对各种参数的检测，才能对生产过程进行定性和定量的描述，才能实现对发酵过程

33、的控制。ü发酵参数可正确反映发酵条件和代谢的变化。因此，通过对发酵参数的检测可较好地指导生产，实现对发酵的控制。发酵工程的基本任务是高效利用微生物所具有的内在生产力，以较低的能耗和物耗最大限度的生产生物产品。要达到这样的目的，主要取决于能否维持一个生长受控的和对生产良好的环境，而要达到这样的环境，最直接和最有效的方法是通过直接测量发酵的变量来调节生物过程。因此，在线测量是高效过程运行的先决条件。在线检测对于发酵过程的控制具有十分重要的意义。生物传感器：将生物体的成份（酶、抗原、抗体、激素）或生物体本身（细胞、细胞器、组织）固定化在一器件上作为敏感元件的传感器称为生物传感器。发酵过程的

34、参数检测的内容（1）直接状态参数：能直接反映发酵过程中微生物生理代谢状况的参数。包括：物理参数：温度、压力、搅拌速度、搅拌功率、空气流量、浊度、黏度；化学参数：PH、基质浓度、溶解氧（DO）浓度、氧化还原电位、产物浓度、尾气O2和CO2浓度以及其他参数；生物参数菌丝浓度。（2）间接状态参数：由直接参数计算求得的参数。包括：生长速率、摄氧率、CO2释放速率、呼吸商、氧得率系数、氧体积传质速率等。发酵罐：进行微生物深层培养的生物反应器统称为发酵罐。常用发酵罐：机械搅拌发酵罐：是发酵工厂常用类型之一，也叫标准通用式发酵罐。指带有通气和机械搅拌装置的发酵罐。气升式发酵罐依靠无菌压缩空气作为液体的提升力

35、，使罐内发酵液通过上下翻动实现混合和传质传热。特点：结构简单、无轴封、不易污染、氧传质效率高、能耗低、安装维修方便。管道式发酵罐以发酵液的流动代替搅拌作用，依靠液体流动，实现通气混合与传质等目的。固定化发酵罐一种在圆筒形的容器中填充固定化酶或固定化微生物进行生物催化反应的装置。优点是生物利用率高。自吸式发酵罐：一种无需其他气源的提供压缩空气的发酵罐，其关键部位是带有中央吸气中的搅拌器。适用于耗氧很低发酵类型。伍氏通风发酵罐主要部件是套筒、搅拌器。二、通风固态发酵设备（一）分批式固态发酵设备：制盘曲的曲盘 制帘子曲的帘子厚层通风制曲装置 自动化制曲装置流化床式固态发酵设备。其中，厚层通风制曲装置

36、是目前国内使用较多的分批式通风固态发酵设备。发酵工业定义：是指利用生物的生命活动产生的酶，无机或有机原料进行酶加工，获得产品的工业。获得发酵产品的条件：适宜的微生物；保证或控制微生物进行代谢的各种条件；进行微生物发酵的设备；精制成产品的方法和设备发酵过程：（发酵过程中离不开微生物的作用）1、发酵原料的选择及预处理2、微生物菌种的选育及扩大培养3、发酵设备选择及工艺条件控制：常温、常压。种子扩大培养和发酵采用不同的工艺。4、发酵产物的分离提取 5、发酵废物的回收和利用发酵方法的类别根据对氧的需要区分：厌氧和有氧发酵 根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵根据从微生物生长特性区分：分批发酵和连续发

37、酵发酵的类型按是否需氧按培养基类型好氧发酵厌氧发酵兼性厌氧发酵液体发酵固体发酵浅层发酵深层发酵分批发酵补料分批发酵连续发酵常用的工业微生物菌种：霉菌、细菌、酵母菌、放线菌、病毒、藻类、食用真菌（担子菌）。十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。经典育种：如自然选育和诱变育种（物理、化学方法）。带有一定的盲目性。定向育种：（1）杂交育种、原生质体融合技术、基因工程、抗噬菌体菌种的选育等。（2）有目的地选育出新的优良菌种。常规育种：1.突变和选择是微

38、生物菌种选育的基本手段（A.自发突变B.各种因子的诱变与筛选）。2.传统的菌种筛选步骤。3.理性化筛选技术快速筛选方法：1、平皿快速检测方法2、形态变异法3、高通量筛选法4、纸片培养显色法2.种子的扩大培养的原因现代发酵工业的规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要在较短的几十小时内完成如此巨大的发酵转化任务，就必需具备数目巨大的微生物细胞。并且，接种量越大，发酵时间就越短，就可提高发酵罐的利用率，并且可减少杂菌污染的机会。因此，就需要对微生物的菌种进行扩大培养。二、种子质量的控制措施（一）菌种稳定性的保持1. 生产上每年都应进行一次菌种复壮。复壮方法：即对菌株进行自然分离

39、。将保藏菌株溶于无菌的生理盐水中，逐级稀释，然后在培养皿琼脂固体培养基上划线培养，长出菌落，选择形态优良的菌落接入三角瓶进行液体摇瓶培养，检测出生产率高的菌种备用。2.控制传代次数：避免不必要的移种和传代，尽量降低菌种衰退的机率，将必要的传代降到最低水平。（二） 无杂菌检查：在种子制备过程中，每移种一次均需要进行种子是否染菌的检查。以便在出现问题后，查找原因。方法：1、种子液显微镜观察。2、无菌试验：显微镜观察，或将种子涂在平板上划线培 养、斜面培养、酚红肉汤中培养，观察有无异常菌落，定时检查，防止漏检。3、对种子液进行生化分析：主要是取样测定其营养消耗的速度、pH变化、溶氧利 用情况、色泽、

40、气味是否异常等。三、菌种培养的类型 静置培养法：嫌气性发酵，也有好气性发酵两大类型 通气培养法：好气性发酵 需氧菌、兼性需氧菌液体培养形式又分均有表面培养和深层培养两种固体培养（一）微生物的代谢 代谢是指发生在活细胞中的各种分解代谢（catabolism）和合成代谢（anabolism）的总和。而分解代谢与合成代谢中还包含了初级代谢和次级代谢。即：新陈代谢=分解代谢+合成代谢（二）分解代谢是指微生物将从环境中吸收的各种碳源和氮源中复杂的有机物分子通过分解代谢酶系的催化，降解为简单分子、腺苷三磷酸（ATP）形式的能量和还原力（或称还原当量，一般用H来表示）的过程。它为细胞生命活动提供能源和小分子

41、中间体。（三）合成代谢合成代谢与分解代谢正好相反，是指在合成代谢酶系的催化下，由简单小分子、ATP形式的能量和H形式的还原力一起合成复杂的大分子的过程。即利用分解代谢的能量和中间体合成氨基酸、核酸等单体物质，以及蛋白质、核酸、多糖等多聚物。微生物初级代谢的产物是指伴随微生物正常代谢作用所产生的微生物自身繁殖所必需的代谢产物。如由单体组成的各种大分子聚合物：蛋白质、核酸、多糖、脂肪等。现代发酵工业要研究的主要内容就是通过改变培养条件和遗传特性，使微生物的代谢途径改变或代谢调节失控而获得某一发酵产物的过量产生。其方法大体可分为两类：1、通过微生物育种改变产生菌的基因型从而改变代谢途径；2、控制微生

42、物的各种培养条件，影响其代谢过程，改变控制代谢速率，即影响基因型的表达。各类培养基的共同点：能源、碳源、氮源、无机元素、生长因子以及水、氧气等。即：碳源、氮源、无机盐和微量元素、水分、促进剂（聚乙烯醇改善通气性）和抑制剂、前体（青霉素苯乙胺）。发酵培养基的设计原理：（要考虑：某菌种对培养基的基本要求。满足微生物生长以及产物合成的需要。菌体的同化能力。培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响。碳氮比对菌体代谢调节的重要性。pH对不同菌体代谢的影响。）1.营养物质应满足微生物的需要2.营养物的浓度及配比应恰当：营养物的浓度太低，则不能满足微生物生长的需要，浓度太高，又会抑制微生物的生长。如糖和盐都是良好

43、的营养物质，但是，浓度升高，则有抑菌作用。在考察培养基组成时人们常以碳氮比作为一个重要的指标。一般培养基C/N比为100：0.52；在谷氨酸生产菌发酵中，C/N比为4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累量较少；当C/N为3/1时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸大量积累。3.物理化学条件适宜 ： pH值 此外还有水分活度、渗透压、氧化还原电位等，也要考虑。培养基优化设计的方法生态模拟 参阅文献 组分更换正交试验法：是安排多因子试验常用的一种方法，可以用少量的具有代表性的试验代替全面试验，较快地取得实验结果。灭菌（sterilization）：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖

44、能力的措施，称为灭菌，例如各种高温灭菌措施等。灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者则指菌体杀死后，其细胞发生溶化、消失的现象。影响培养基灭菌的因素：1、培养基的成分；2、培养基pH值的影响 ； 3、培养基的物理状态；4、泡沫；5、培养基中微生物的数量灭菌的实际操作：（一）发酵罐的灭菌方法：空消、实消（二）液体培养基的灭菌方法：分批灭菌（实消）、连续灭菌（连消）（三）固体培养基的灭菌方法（四）其他设备的灭菌具体灭菌方法：种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌：、空罐灭菌（空消） 2、实罐灭菌（实消，分批灭菌）3、连续灭菌（又叫连消）、空罐灭菌也称空消：方法

45、：一般从管道通入蒸汽，使罐内压力为0.147MPa，维持40min，灭菌结束，关闭蒸汽，在保温结束后，关键是随即通入无菌空气，使容器保持正压（0.098MPa），防止形成真空而吸入带菌的空气。2、实罐灭菌即分批灭菌：将培养基置于发酵罐中用蒸汽加热，达到预定灭菌温度后，维持一定时间，再冷却到发酵温度，然后接种发酵的灭菌方法，又称分批灭菌。发酵罐、种子罐等和培养基一起的灭菌。它包括升温、保温、降温三个阶段。灭菌效果可靠，对蒸汽要求低，一般（34）×10 Pa（表压）即可。灭菌标准是121，1530min。3、连续灭菌（又叫连消）：（1）液体培养基的连续灭菌又称连消，就是将配制好的培养基在

46、向发酵罐输送的同时进行加热、保温和冷却的过程，从而达到灭菌的效果。（2）在培养基连续灭菌过程中，蒸汽用量平衡，但蒸汽压力一般，要求高于5 × 10 Pa（表压）。灭菌标准是130，5min。（3）适于自动控制。（4）其所用设备多而复杂，投资较大。固体培养基的灭菌（1）固体培养基现主要采用旋转蒸煮锅（灭菌蒸汽压力0.098MPa，维持2030min）进行灭菌，实现了机械化（过去手工操作）。（2）主要用于：固体曲、固体发酵原料的灭菌（3）固体培养基的特点：呈片状或粒状，不易翻动，吸水后加热易成团，冷却困难（因此，旋转蒸锅较适合它的特点）。（4）设备结构：旋转蒸煮锅有单头（出口）和双头两种

47、，由钢板焊制能承受一定压力，锅中心有空心横轴，轴则装在支架两端的轴承中，借齿轮转动。发酵对无菌空气的要求是 ：无菌，无灰尘，无杂质，无水，无油，正压等几项指标；在工程设计中一般要求1000次使用周期中只允许有一个菌通过，即经过滤后空气的无菌程度为N=10-3。空气除菌的方法： 空气除菌就是除去或杀死空气中的微生物。包括辐射杀菌、加热杀菌、静电除菌、过滤除菌。空气净化流程：吸气口吸入的空气先经过压缩前的过滤。进入空气压缩机（先升温至120150）。冷却（2025 ），除去油、水，再加热至3035 。最后通过总过滤器和分过滤器除菌，获得洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。空气过

48、滤除菌介质：、棉花：、玻璃纤维、活性炭、超细玻璃纤维纸代谢变化：就是反映发酵过程中菌体的生长，发酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。发酵动力学：究发酵过程中菌体生长、基质消耗、产物生成的动态平衡及其内在规律。并以数学、工程学的原理，定量描述。其实质是研究微生物的代谢变化规律。分批发酵的动力学类型：按照菌体生长，碳源消耗和产物形成的变化分类：型、型、型。按照产物生成与菌体生长是否同步分类：生长关联型 (型）、生长无关联型（、型） 型（部分生长关联型）产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰。例

49、如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。型（非生长关联型）产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级代谢是分开的。如抗生素发酵。补料分批发酵及其动力学即在分批培养伊始，投入较低浓度的底物，然后在发酵过程中，当微生物开始消耗底物后，再以某种方式向培养系统中补加一定的物料，使培养基中的底物浓度在较长时间内保持在一定范围内，以维持微生物的生长和产物的形成，并避免不利因素的产生，从而达到提高容积产量、产物浓度和产物得率的目的。补料分批发酵的类型补料方式：连续流加、不连续流加、多周期流加补料成分：单一组分流加、多组分流加、控制方式：反馈控制（以DO值为反馈指标等）、无反馈控制

50、影响发酵温度的因素：产热因素：生物热、搅拌热、通气热 散热因素：蒸发热、辐射热。pH值对微生物的生长繁殖和产物合成的影响：（1）pH影响酶的活性（2）pH影响微生物细胞膜所带电荷的状态（3）pH影响培养基某些组分和中间代谢产物的离解（4）pH不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变温度对发酵的影响：影响各种酶的反应速率和蛋白质性质；影响发酵液的物理性质；影响生物合成的方向。溶氧对发酵的影响：由此可知，只有使溶氧浓度高于其临界值，才能维持菌体的最大比摄氧率，得到最大的菌体合成量。如果溶氧浓度低于临界值，则菌体代谢受到干扰。但是，发酵工业的目标是要得到菌体发酵的产物而不是菌

51、体本身。因此，由氧饥饿而引起的细胞代谢干扰，可能对形成某些产物是有利的；同理，当提供的氧浓度远大于临界值时，虽对菌体形成无妨，但也许能刺激产物的形成；所以，某种产物形成的最佳条件可能不同于菌体生长的最佳通气条件。基质浓度对发酵的影响：（1）碳源（2）氮源（3）磷酸盐菌体浓度对发酵的影响：补料控制的策略:大多数补料分批发酵均补加生长限制性基质;以经验数据或预测数据控制流加；以pH、尾气、溶氧、产物浓度等参数间接控制流加；以物料平衡方程，通过传感器在线测定的一些参数计算限制性基质的浓度，间接控制流加；用传感器直接测定限制性基质的浓度，直接控制流加常用的反馈控制参数.。菌体自溶的迹象：氨基酸开始升高

52、、pH值上升、菌丝碎片增多、粘度增加、过滤速度降低等。直接状态参数：能直接反映发酵过程中微生物生理代谢状况的参数。包括：物理参数、化学参数、生物参数 。间接状态参数：由直接参数计算求得的参数。一、直接状态参数（一）物理参数1、温度 2、压力 3、搅拌转速4、搅拌功率 5、空气流量 6.粘度 7、浊度（二）化学参数：1、ph 2、基质浓度 3、溶解氧（DO）浓度 4、氧化还原电位 5、产物浓度 6、尾气O2浓度和CO2浓度 7、其它参数（三）生物参数：菌（丝）体浓度（生物量biomass）二、间接参数 1、摄氧率 3、呼吸商 2、呼吸强度 发酵过程参数检测方式 、利用仪器进行在线检测:所用仪器：

53、传感器。 用于测定：罐温、压力、空气流量、电机显示搅拌转速等，以及测量状态参数pH、溶CO2和溶氧等。 、从发酵罐中取样品进行离线检测常采用的分析方法有：湿化方法、分光光度、原子吸收、HPLC、 GC、 GCMS、核磁共振（NMR）等。 用于测定：发酵中的基质（糖、脂质、盐、氨基酸）、前体和代谢产物质（抗生素、酶、有机酸和氨基酸）以及菌量等。 物理参数常用的检测方法化学、生物参数的测定方法种子罐染菌的处理：及时用高压蒸汽直接灭菌后排放。染菌后设备处理：用化学物质处理（如甲醛熏蒸）或彻底清洗，再用蒸汽灭菌（120，30min以上）。啤酒的连续发酵罐种类1两个搅拌罐和一个酵母分离罐串联起来，加入酒花的麦芽汁流加入第一个搅拌罐，经发酵后，成熟啤酒从分离罐中流出。这种流程已达到日产100m2的规模。2由数个高度69m的塔式发酵罐串联起来，附加一些酵母分离和啤酒贮藏设备。还有一个由主发酵塔和一个发酵塔组成，发酵周期40、50h，连续发酵两个月，各项经济指标均优于间歇法。 间歇发酵：操作简单，发酵周期长，发酵罐数多，设备利用率低。连续发酵：培养液浓度和代谢产物含量相对稳定，发酵周期短，设备利用率和生产效率高，易于自动化生产。连续发酵存在的问题：（1）微生物的突变（2）污菌（3