国家自然基金标书-终稿

1、报告正文立 项依据与研究内容( 4000-8000 字) ：1 、 项目的立项依据随着机械通气、表面活性物质替代疗法等新技术应用，危重新生儿、尤其是早产儿存活率已显著提高。然而， 长时间吸入高浓度氧，幸存者易发生肺部氧化应激损伤。目前，高氧肺损伤已成为发达国家NICU 最为棘手的问题之一和婴儿慢性肺疾病的最常见形式。但高氧肺损伤的确切机制尚未完全阐明，更无有效的防治手段。因此深入研究其发病机制，积极防治高氧肺损伤，具有优生优育、提高人口素质的战略意义。高氧肺损伤是一个涉及许多细胞活动的复杂过程，可分为早期的组织损伤(弥散性肺泡炎)和晚期的损伤后修复(肺间质重构)两个过程。细胞外基质(extra

2、cellularmatrix,ECM)的重建参与了高氧肺损伤的整个病理过程，若ECMg建正常，则损伤完全修复，肺结卞正常；若ECM1建紊乱，将导致肺纤维化。因此，ECM1建是关系高氧肺损伤结局的关键因素。本实验室在国内外率先开展了对早产大鼠高氧肺损伤中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases , MMPS 和其抑制剂 (tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)表达的研究，已发现肺损伤时MMPs过度表达、MMPs/TIMPs失衡是ECM重建紊乱发生纤维化的关键原因1(具体研究成果见研究基础栏)。有关MMPs&高氧

3、肺损伤中的作用已为少数国外学者所重视，但高氧肺损伤后ECM重建过程中，引起MMP氮度增加的具体机制是什么？本实验室拟从MMPs勺诱导剂和抑制剂两方面深入研究。细 胞 外 基 质 金 属 蛋 白 酶 诱 导 剂 ( extracellular matrix metalloproteinase inducer,Emmprin)在上调 MMP沫达中起关键作用。 Emmprin是分子量为 58KD的质膜 糖蛋白，具有酪氨酸蛋白激酶活性，不仅表达于正常组织，还表达于肿瘤组织如肺部肿瘤细胞，提示Emmprin 参与体内生理及病理过程2 。目前，少数文献已证明，体外Emmprin与人成纤维细胞共培养后， 成

4、纤维细胞MMP费达增加。进一步研究表明， Emmprin在细胞表面与自身受体或 MMP吉合，激活胞内 MAPK p38信号通路，该途径 激活促进 ECM条解3, 4。但关于 Emmprin/MAPK p38对MMP删节的研究仅限于肿瘤 细胞，有关高氧肺损伤后肺 ECM重建过程中，Emmprin如何调控MMPs/TIMPs平衡， 目前国内外尚无文献报道。转化生长因子 3 (Transforming growth factor beta, TGF- 3)在下调 MMP费达中 起关键作用。研究证明TGF叩刺激可使肺成纤维细胞MMPs生成减少5。另有研究发现，TGF叩 抑制元件位于 MMP-1基因启动

5、子区， 严密调控 MMP-1在不同生理和病理 情况下的表达6。进一步的研究表明，TGF叩对MMP-1的作用通过SMAD言号途径介 导，该途径激活可阻止ECM条解5。因此，推测 TGF-3 /SMAD对MMPs/TIMPs平衡的调节可能是影响肺损伤后ECM1建的关键因素之一。有关高氧肺损伤后肺 ECM1建过程中，TGF-3如何调控MMPs/TIMPs平衡，目前国内外尚无文献报道。近年来对信号转导系统的研究发现，位于大多数细胞质膜上约50-100nm 大小的囊性凹陷结构小窝(caveolae ) ，是许多信号分子完成跨膜信号转导的“驿站”。小窝蛋白( caveolin )是小窝胞浆面包被的一种21

6、-24kD 的膜蛋白，是许多信号分子活性状态的重要调节者。在无胞外信号刺激下，caveolin 通常与富集于小窝质膜上的各种信号分子、受体及非受体型酪氨酸激酶等相结合，抑制这些信号物质的活性；在激动剂与受体结合后，caveolin 分子构象发生变构或共价修饰，调节信号物质的活化状态，参与信号车t导调控7。有关caveolin在月ECM1建中的作用，有学者提出肺泡I型上皮细胞 caveolin 表达缺失可能是发生肺纤维化的亚细胞指标。对caveolin-1 基因敲除小鼠的研究，肺组织显示肺泡隔因细胞增殖而增厚和肺纤维化。caveolin-1 ”在肺发育的不同阶段，可表达于不同血管和上皮细胞，呈时

7、相分布8。研究发现，caveolin -1与TGF-3 I型受体（T3 RI）相互作用，抑制TGF叩介导的SMAD-2和下游分子的磷酸化，从而调节信号转导9 。Emmprin具有酪氨酸蛋白激酶活性，且其信号传导为酪氨酸磷酸化依赖的MAPK p38途径，申请者推测 caveolin 能与Emmprin相互作用，调控Emmprin介导的MAPK p38和下游分子的磷酸化。简图如下：胞外信号刺激caveolin+?变构活化 + >caveolin/Emmprin 作用caveolin/T 肥 I 作用 一t TGF- SMADEmmprin/MAPK p38信号整合调控肺ECM重建基于上述，申

8、请者提出如下假设：高氧暴露下MMFW导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPS曾力口，ECMM建紊乱的主要原因。高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而 影响Emmprin/MAPKp38和TGF-3 /SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPS曾力口，ECMt建紊乱。本人所在的研究室属呼吸系统疾病重点实验室。多年来，本人一直致力于新生儿高 氧慢性肺损伤的研究，已成功建立了早产大鼠高氧肺损伤的动物模型、掌握了支气管肺 泡灌洗术、体外H型肺泡上皮细胞和成纤维细胞培养、核酸、蛋白分析等技术，并对抗 氧化酶、细胞因子水平、一氧化氮、MMPs/TIMPs失衡等因素在高氧肺损伤发病机制中所起的作用进行了较深入的

9、研究，同时应用地塞米松、维甲酸、人类重组促红细胞生成素、 EGb761进行了抗氧化损伤的干预研究（见研究基础栏）。这些理论研究和技术方法的积累 为本课题的开展奠定了坚实的基础。本研究如能完成，可望为探索高氧肺损伤后肺ECM重建紊乱的机制开拓新思路，并为寻找有效的预防和干预高氧肺损伤提供依据。参考文献1. Taylor PM, Woodfield RJ, Hodgkin MN et al.Breast cancer cell-derived EMMPRIN stimulates fibroblast MMP2 release through a phospholipase A(2) and 5-

10、lipoxygenase catalyzed pathway. Oncogene 2002 Aug 22;21(37):5765-722. Liang L, Major T, Bocan T.Characterization of the promoter of human extracellular matrix metalloproteinase inducer (EMMPRIN). Gene 2002 Jan 9;282(1-2):75-863. Lim M, Martine T, Jablons D. Tumor-derived EMMPRIN(extrocellular matrix

11、 metalloproteinases inducer) stimulates collagenase transcription through MAPK p38. FEBS Lett 1998;441(1):88924. Yuan W, Varga J. Transforming growth factor-beta repression of matrix metalloproteinase-1 in dermal fibroblasts involves Smad3. J Biol Chem 2001;276(42):38502-105. White LA, Mitchell TI,

12、Brinckerhoff CE. Transforming growth factor beta inhibitory element in the rabbit matrix metalloproteinase-1 (collagenase-1) gene functions as a repressor of constitutive transcription. Biochim Biophys Acta 2000 Feb 29;1490(3):259-686. Razani B, Zhang XL, Bitzer M, et al. Caveolin-1 regulates TGF-be

13、ta/SMAD signaling through an interaction with the TGF-beta type I receptor. J Biol Chem 2001;276 (9):672767387. Ramirez MI, Pollack L, Millien G , et al. The alpha-Isoform of Caveolin-1 Is a Marker of Vasculogenesis in Early Lung Development. J Histochem Cytochem 2002;50(1):33428. Drab M, Verkade P,

14、 Elger M, et al. Loss of caveolae, vascular dysfunction, and pulmonary defects in caveolin-1 gene-disrupted mice. Science 2001;293(5539):2449522、 项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。研究目标：建立早产大鼠慢性高氧月损伤模型，探讨 Emmprin与TGF叩调节失衡是否为高氧肺损伤MMPS曾加，ECM®建紊乱的主要原因；探讨小窝蛋白对Emmprin/MAP38和TGFg/SMAD两条信号通路整合的影响，为高氧肺损伤发生机制和寻找有效

15、防治措施提供理论依据。研究内容：1. Emmprin/MAPK p38 信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM 重建紊乱的相关性：研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中Emmprin、P38、磷酸化P38的表达。研究高氧肺损伤Emmprin/MAPK p38信号通路活化状态与 MMP豉达双变量关系。2. TGF- 3/SMAD信号通路活化状态及高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的相关性： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中TGF-3、T3 RI、SMAD磷酸化SMAD勺表达。研究高氧肺损伤 T3RI的激酶活性，计算磷酸化SMADT非磷酸化SMAD：匕值。 研究高氧肺损伤 TGF叩/SMAD信号通路的活化状态

16、与MMPs/TIMPs的双变量关系。3. caveolin-1对Emmprin/MAPK p38 和TGF- 3/SMAD两条信号通路及其与高氧肺损伤所致 ECM 重建紊乱的相关性： 研究高氧肺损伤不同时间点肺组织中caveolin-1 表达及酪氨酸磷酸化水平。 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1 与 Emmprin 的共定位。 研究高氧肺损伤肺组织质膜小窝内caveolin-1 与T3 RI的共定位。拟解决的关键问题：1. 成年动物急性高氧肺损伤模型，因其肺发育已成熟，不能如实反映不成熟肺的损伤情况，并且与临床上早产儿需长期用氧情况差异较大。本项目采用早产大鼠慢性高氧肺损伤模

17、型，能更如实模拟支气管肺发育不良的发生情况。虽然此模型技术难度较大，但本研究组在早产大鼠模型制备方面已积累了丰富经验，能成功完成此模型的复制。2. 本研究假设caveolin 与 Emmprin 的相互作用可调控Emmprin/MAPK p38 信号通路活化；caveolin-1 与T 3 RI的相互作用可调控 TGF-3 /SMAD信号通路活化。以往由于 技术条件限制，未能从形态学上直接证实。借助共聚焦显微镜观察和荧光双重标记技术可解决这一技术难题。3. 拟采取的研究方案及可行性分析。研究方法：本课题采用共聚焦显微镜(confocal microscope ) 、免疫荧光双重标记和免疫组织化

18、学等研究方法，辅以蛋白质与核酸分析技术（ Western Blot、Northern Blot 方法）， 检测各指标的动态变化，并对各指标进行定位、定性、定量分析。1.建立早产大鼠慢性高氧肺损伤模型： 参照申请者著作，实用儿科临床杂志，.检测caveolin-1酪氨酸磷酸化水平：应用抗caveolin-1pAb 进行免疫沉淀应用抗磷酸化酪氨酸mAb进彳W Western Blot 分析.检测肺组织中 Emmprin、P38、磷酸化P38、TGF- 3、TGF- 3 I型受体T况I ）及 SMAD-2、磷酸化SMAD表达，探讨高氧肺损伤所致ECM重建紊乱的分子机制：蛋白质水平检测一Western

19、 Blot 。 mRNAK平检测一Northern Blot （或 RT-PCR。.检测肺组织中T五I的激酶活性：T 3 RI分离提取一免疫沉淀法（immunoprecipition ）T 3 RI与纯化的激酶底物 GST-SMAD2由美国国立癌症研究机构de Caestecher,M教授提供）反应，应用免疫印迹法检测磷酸化SMAD水平，计算T3 RI的激酶活性。.检测肺组织质膜小窝内caveolin /Emmprin 及caveolin-1/T 五I的共定位及表达：样本制备：制备组织切片一加入抗caveolin mAb 一 PE标记的二抗一加入抗Emmprin/T 3 RI 的 pAb FI

20、TC 标记二抗共聚焦显微镜（TCSSPil,彳i国Leica公司）检测共定位；应用图象分析软件 对caveolin 表达强度进行半定量。.应用统计学方法处理数据：应用SAS统计分析软件，对数据进行统计学分析。技术路线：Emmprin、P38、磷酸化 P38 表达（免疫印迹与 Northern Blot 或 RT-PCR）TGF-3、T3R、SMAD 磷酸化 SMAD 表达（Western Blot 和 Northern Blot ）T3 RI激酶活性（免疫沉淀和免疫印迹）caveolin/Emprin 共定位（荧光双标记、共聚焦显微镜）可行性分析:caveolin/ T3 RI共定位（荧光双标

21、记、共聚焦显微镜）1 .申请者所在的研究室属于呼吸系统疾病重点实验室临床二室，本室在慢性阻塞性肺疾病和肺纤维化发病机制的研究领域已有大量工作积累，为本项目的研究打下了良好的 工作基础。申请者及所在研究室在产儿高氧损伤领域进行了一系列开拓性研究，已熟练掌握急、慢性高氧肺损伤模型复制，蛋白、核酸分析等技术。（详见研究基础栏）2 .本项目研究的主要成员之一，香港合作者教授，是国际上新生儿肺损伤研究的前沿科 学家，目前与本研究小组密切合作，进行有关慢性肺损伤研究。霍泰辉教授除承担实 验指导，并提供部分试剂。3 .新一代共聚焦显微镜具有观察亚细胞结构的立体定位功能，用其检测在体组织 caveolin/E

22、mmprin 、caveolin/ T 3 RI信号分子在亚细胞位点的共定位表达，虽无文 献报道，在技术上难度较大，但申请者已掌握了多种荧光标记技术，应用共聚焦显微 镜观察caveolin-1 在细胞质膜上的定位表达也已获成功。申请人所在单位的医学中心的共聚焦显微镜和本实验室的基本研究设备，能保证本实验研究完成。4、本项目的特色与创新之处。理论上的创新：研究Emmprin/MAPK p38信号通路在器官发育和组织病理损伤中的作用，国内外尚无文献报道。本课题研究 caveolin 对Emmprin/MAPKp38、TGF叩/SMAD调节机制， 将为早产儿高 氧肺损伤发病机制开辟新的研究领域，并为

23、其防治开拓新思路。方法上的创新：以在体组织为研究对象，应用免疫荧光双重标记共聚焦显微镜技术研究 caveolin/Emmprin 、caveolin/T 3 RI共定位，国内外未见文献报道，可望为深入研究 小窝蛋白对信号转导的调控机制开辟新途径。5、年度研究计划及预期研究结果。年度研究计划及预测进展本课题研究内容预计用3年时间完成.2004 年1月8月购买所需试剂。建立预实验动物模型。进行各项预实验。2004 年9月2005年2月建立动物模型。完成标本的收集。2005 年3月7月完成 MMPs TIMPs、TGF-3、T3 RI、SMAD2M其mRN“达的研究，并进行阶 段性总结。2005 年

24、8月2005年12月完成caveolin-1 表达和caveolin-1/T 3 RI共定位研究，并进行阶段性总结。2006 年1月2006年6月完成 caveolin-1 的酪氨酸磷酸化状态研究，并进行阶段性总结。2006 年 7 月 12 月 研究数据资料分析、总结、论文撰写及成果鉴定。预期研究成果本项目所建立的早产新生大鼠慢性高氧肺损伤模型，不仅为本课题提供了研究对象，而且为研究高氧肺损伤后肺ECMB建提供了模型。本研究可望为阐明早产儿高氧肺损伤机制提供新的线索：高氧暴露下MMPI导剂/抑制剂失衡是高氧肺损伤MMPS曾加，ECM重建紊乱的主要原因。高氧暴露使质膜小窝表达或功能异常，从而影

25、响Emmprin/MAPK p38和TGF-3 /SMAD两条信号通路整合，继而导致MMPS曾加，ECM1建紊乱。本研究内容也可能为预防和干预高氧肺损伤提供理论依 据。（二）研究基础与工作条件1 、工作基础1. 与本项目有关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩本课题组多年来一直进行高氧肺损伤的发病机制及防治的研究，做了许多基础和临床研究工作。已成功建立早产新生大鼠高浓度氧（853 95%急性肺损伤和慢性肺纤维化的模型；已完成肺组织中各种抗氧化酶活力、羟脯氨酸含量与肺纤维化的相关性研究；内源性一氧化氮在高氧肺损伤中双重作用的研究；体外高氧对肺泡巨噬细胞分泌IL-8的影响研究；TGF叩在早产大鼠高

26、氧肺损伤肺组织中表达的研究；基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用机制的研究；及促红细胞生成素、地塞米松、维甲酸对新生鼠高氧肺损伤的干预研究。获奖课题 目前正承担的相关科研项目:1.2.相关研究工作发表的文章：附： 基质金属蛋白酶及其抑制剂在高氧肺损伤中的作用1. 高氧组病理学改变2. 高氧组 MMPs 表达图 1 肺发育不良，示肺泡图2细胞增生、间质纤维图 3 MMP-2 强阳性表达数目减少、结构简单化改变3. 酶谱法测BALF 中明胶酶活性4. 高氧暴露后MMPs、TIMPs表达增加MMP-2MMP-9TIMP-1TIMP-23d O20.46± 0.360.90± 0.642.00± 0.470.30± 0.23air0.07± 0.100.07± 0.160.87± 0.580.03± 0.087d O