微量海人藻酸刺激大鼠延髓网状背侧亚核后脊髓和三叉神经脊束核尾

1、            凌树才*?李云庆施际武 (第四军医大学解剖学教研室梁銶琚脑研究中心，西安710032； *南通医学院神经生物学研究室，南通226001) 摘要为了观察起自延髓网状背侧亚核(SRD)的下行投射对脊髓和三叉神经脊束核尾侧亚核(Vc)神经元活动的影响，将微量海人藻酸注入大鼠SRD中，致SRD神经元兴奋，在SRD下行通路的作用部位引起c-fos的表达。实验结果表明，在注射后30min，脊髓灰质内出现Fos阳性神经元，1.52h时达高峰，4h后明显减少。在高峰期

2、，同一脊髓节段的不同板层内Fos阳性神经元的密度不同：、层>、层>、层，、层中偶见。Vc内Fos阳性神经元的出现时间和分布与脊髓后角相似。上述结果提示，SRD发出的下行纤维主要调控脊髓和Vc(尤其是浅层)中的神经活动。 关键词延髓网状背侧亚核下行通路海人藻酸c-fosBSI-B4大鼠 近年来电生理研究资料表明，延髓网状背侧亚核(subnucleus reticularis dorsalis,SRD)是参与“弥散型伤害性抑制调控”(diffuse noxious inhibitory controls,DNIC)的重要核团1,2。形态学研究结果也表明，在SRD与脊髓之间存在着往返纤维

3、联系构成的神经环路，并且认为这种环路是DNIC调控的结构基础35。然而伤害性信息的调控较复杂，常常涉及到多级神经元的多突触联系，但目前常用的示踪剂很难跨突触转运，只能反应某核团的一级联系，要完整地显示一条神经通路需多次追踪才能完成，而且还不能直接说明其功能上的联系，1987年Morgan6等创立了c-fos原癌基因表达法，在神经科学领域已被广泛的应用，包括用于检测外周受伤害性刺激激活的中枢多极神经元功能通路。最近也有用微量海人藻酸注入大鼠中缝大核导致脊髓神经元c-fos表达的报道7。为了观察SRD在功能上与脊髓和Vc中的哪些板层的核团发生联系，本研究将微量海人藻酸注入SRD，使SRD神经元发生

4、兴奋，经过一定时间后，观察脊髓和Vc中Fos阳性神经元的分布。 材料和方法 雄性SD大鼠16只，体重200300g，分为实验组(n=14)和对照组(n=4)。 1.实验组 1.1动物准备：将动物置于温暖、安静、避强光的环境下饲养1周，使之完全适应周围环境，以维持良好的基础状态。 1.2手术过程：先用乙醚诱导麻醉，然后肌注Ketamine(0.5ml/只)维持麻醉，手术暴露闩平面以下的延髓，直视下用微玻管将生理盐水配制的0.1l海人藻酸(20mol/L，其中加少量台盼蓝)注入一侧SRD。手术过程在10min内完成，术后将动手放回术前相同的环境中，动物在术后35min清醒，分别存活30min(n=

5、2)，1h(n=2),1.5h(n=6),2h(n=2),4h(n=2)。这期间注意观察动物的状态和行为变化。 1.3材料制备：各组实验动物成活至预定的成活期，用戊巴比妥钠深麻，开胸，经升主动脉依次灌注生理盐水100150ml及含4%多聚甲醛和0.2%苦味酸的0.1mol/L PB(pH7.4)500ml，灌毕立即取延髓和脊髓的代表性节段(C56,T45,L36及S24)并浸入30%蔗糖(0.1mol/L PB配制)中过夜(4)，冠状冻切，片厚30m，隔4片取1，取3组收集于0.01mol/L PBS内。 1.4Fos免疫组织化学染色：第1，2组切片分别入(1)羊抗Fos血清(Cambridg

6、e Res Bio Chiemical,UK,11 4 000)，用含0.2%Triton X-100的PBS稀释，室温下孵育1h后移入冰箱(4)中孵育48h；(2)生物素结合的兔抗羊IgG(Vector,1200，PBS稀释)，室温下孵育4h；(3)Avidin-HRP(Vector,1300,PBS稀释)室温下孵育2h。以上各步骤之间均用PBS漂洗3次，每次5min，最后按GOD-DAB-Ni法呈色，反应时间为2025min。将第1组切片裱片，晾干，脱水，透明，DPX封片，Olympus显微镜观察并摄片。为了分析Fos阳性神经元与初级传入C纤维终末的关系，将第2组切片在完成上述染色后，置入

7、BSI-B4(Bandeiraea Simplicifolia Isolectin-B4)-HRP(18 000,Sigma)，室温下孵育3h切片，再用DAB-H2O2方法呈色。第3组切片行Nissl染色。 1.5脊髓内Fos样阳性胞核分布的图像分析：将Leica Q500MC图像分析仪的摄相系统连接于Olympus BX-50光学显微镜上，对灰度值612区间的Fos阳性胞核按核团或板层层次分布进行观察分析，自动记录出其数目和面积的百分比,得出脊髓灰质各层内c-fos表达的密度。为了便于分析，根据图像分析得出的结果(Fos阳性胞核面积占测量总面积的百分比),将脊髓灰质各层中的Fos阳性胞核的密

8、度分成以下几个等级：+ ·(>12%)、+ ·(9%12%)、+ ·(5%8%)、+ ·(14)、±(偶见)。 2.对照实验 2.1手术对照(n=2)：动物术前的饲养环境、手术过程及染色程序与实验组完全相同，只是注射液不含海人藻酸，动物术后成活1.5h。 2.2Fos免疫组织化学对照(n=2)：取1套实验组大鼠的切片，用正常羊血清(1100)代替一抗，其余步骤不变。 结果 实验组动物接受海人酸注射后35min即清醒，伴轻度的躁动不安和探究活动增加，这种行为变化一般持续58min后变安静，对照组动物在术后没有行为改变。 光镜观察，台盼蓝显示

9、的注射区均在SRD的范围内(图1)，没有扩散到邻近的核团。给予海人藻酸刺激后，两侧脊髓灰质中Fos阳性神经元的数量相近，无明显的差别，但是各层中的Fos阳性神经元的数量差异很大，并且随存活时间的不同而出现动态变化。详见附表。 附表海人藻酸注入SRD后脊髓灰质各层中Fos阳性神经元的密度 Table The density of c-fos positive neurons in different laminae of the spinal gray after kainic acidinjection into the SRD 脊髓板层 laminae of spinal gray 存活期(survival period) 0.5h 1h 1.5h 2h 4h + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - ± ± - - - ± ± - + + + + + 将微量海人藻酸注入大鼠延髓网状背侧亚核(图1×14)后1.5h,Fos阳性神经元在颈膨大 (图2×35)、胸髓