黄色须腹菌发酵动力学研究

1、黄色须腹菌发酵动力学研究马仕波，叶建仁收稿日期：2013-06-23 修回日期：基金项目：国家林业局林业公益性行业科研专项No.201004061；国家“十二五”科技支撑项目(2012BAD19B0703)作者简介：马仕波(1988-)，男，硕士。*通讯作者（Corresponding Author）：叶建仁，男，教授，博士生导师(南京林业大学森林资源与环境学院，江苏 南京 210037)摘要：本文对黄色须腹菌发酵罐发酵动力学进行了研究。通过分批发酵的方式，明确了发酵罐发酵过程中菌丝体比生长速率为0.158h-1，碳源用于产物积累的得率常数为-0.00035h-1，以及菌丝体生长动力学模型和基

2、质消耗动力学模型。同时对实验数据与模型进行了验证比较，模型计算与实验结果拟合良好，模型能很好地反应黄色须腹菌菌丝体生长及基质消耗过程。关键词：黄色须腹菌，分批发酵，动力学中图分类号：TQ920.1 文献标识码：AFermentation kinetics of Rhizopogon luteousMA Shi-bo, YE Jian-ren*(College of Forest Resources and Environment Nanjing Forestry University, Nanjing 210037)Abstract：It studied the fermentati

3、on kinetics of Rhizopogen luteous. The study suggested that the mycelium specific rate was 0.158h-1 , carbon source for the product accumulation rate constant was -0.00035h-1, and mycelium growth model and substrate consumption dynamics model was obtained in batches. Also we validated with the

4、experimental data. The results showed that the model and experimental data fit well and the two models could reflect the mycelium growth process and the process of dynamic substrate consumption well.Key words：Rhizopogon luteous；Batch fermentation；Dynamics黄色须腹菌是一株优良的侵染松科树种的外生菌根真菌 邵东华,杨喜平.张晓东等.浅黄根须腹菌侵

5、染油松形成外生菌根J.生态学杂志,2013,32(1):78-81，采用生物技术方法利用液体发酵培养黄色须腹菌菌丝体，并利用发酵菌丝液直接进行田间应用是目前最快捷的投入生产实践的应用方法。发酵动力学是研究各种环境因素与微生物代谢活动之间的相互作用随时间的变化而变化的规律的学科 李敏. 褐环乳牛肝菌(Suillus luteus (L.：Fr)Gray)发酵生物学的研究D.内蒙古农业大学,2007。在黄色须腹菌液体发酵罐发酵过程中，通过数学模型定量地描述发酵过程中的菌丝体生长状况，建立其动力学模型能很好地达到对发酵过程有效的控制，从而提高菌丝的产率以及降低生产成本 熊小平,文湘华,徐康宁等. 白

6、腐真菌批式发酵动力学模型研究J. 环境科学. 2008(02):2494-2499。1材料与方法1.1材料1.1.1实验菌株黄色须腹菌(Rhizopogen luteous)，由南京林业大学森林病理实验室提供。1.1.2试剂葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾、维生素B1、氢氧化钠、盐酸、3，5-二硝基水杨酸、丙三醇、琼脂、马铃薯、有机硅消泡剂。1.1.3实验仪器摇床、恒温培养箱、电子分析天平、pH计、Eppendorf离心机、超净工作台、立式电热压力蒸汽灭菌锅、粉碎机、恒温电热鼓风干燥箱、上海国强自动搅拌新概念高级液体发酵罐。1.1.4培养基种子液培养基：马铃薯200g(去皮煮沸过滤取汁)，葡萄糖20

7、g，MgSO4·7H2O1.5g，KH2PO43g，VB10.05g，水1000mL。发酵培养基：马铃薯150g(去皮煮沸过滤取汁)，葡萄糖20g，MgSO4·7H2O1.2g，KH2PO42.5g，水1000mL。 1.2试验方法1.2.1制备种子液将保存的黄色须腹菌菌种无菌条件下接入PDA固体平板上，于28活化培养144h，待菌丝长满平板，无菌操作下，用打孔器(d=7mm)在黄色须腹菌平板菌丝边缘打取小菌饼6块，用挑针转接到装有100mL液体种子液培养基的250mL三角瓶中恒温摇床(28，180r/min)培养144h，把长势旺盛的菌丝体用灭菌的匀浆机打成匀浆，制得种子

8、液。1.2.2发酵罐培养发酵温度设定为28，罐压0.05MPa，装料系数0.5，消泡剂0.05%，接种量5%，初始溶氧量100%，通气流量15L/M，初始转速400rpm，初始pH值5.4，进行发酵罐培养。1.2.3取样和在线监测每12h取样一次，每次取200mL发酵液离心(5000×g，20min)，倒出上清液，测定上清液总糖浓度，滤得菌丝体，80烘干至恒重，称量。溶解氧、pH值、温度、转速、通气量等参数由发酵之星自动在线监测并记录数据。1.2.4溶液配制葡萄糖标准溶液(1g/L)：准确称取 1.00 g 分析纯的无水葡萄糖(100 下烘干至恒重)，溶解于 1000 mL 蒸馏水中

9、。3，5-二硝基水杨酸(DNS)溶液：称取 6.5 g 3，5-二硝基水杨酸溶于少量蒸馏水中，溶解后移入 1000 mL 容量瓶中，加入 2 mol/L NaOH 溶液 325 mL，再加入丙三醇 45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至 1000 mL，然后盛于棕色瓶中，放置备用。1.2.5总糖的测定(DNS法)分别吸取葡萄糖标准液(1mg/mL) ，0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2与10 mL的具塞试管中，准确加入DNS试剂1.5mL，再用蒸馏水补至3.5mL，沸水浴中加热5min，流水冷却，后定溶。在530nm 处测定吸光度，并绘制葡萄糖标准曲线 黄翊鹏,祁静,郑亚军等. 3,

10、5-二硝基水杨酸法测定椰子纳塔发酵液中总糖含量研究J. 广东农业科学. 2009(12):171-174、 单卫华,张玲,时延增,梁瑞雪,尚立霞,胡庆文. 灵芝菌发酵液制剂中灵芝多糖及总糖含量测定J. 时珍国医国药. 2000(09):797-798。取5 mL发酵液5000×g离心20 min，取1 mL上清液于25 mL具塞试管，加入5 mL 的6 mol/L的盐酸，并在沸水浴中加热1530 min，以碘-碘化钾溶液检查其水解是否完全，不呈现蓝色说明水解完全。冷却后转移至三角烧瓶，加入一滴酚酞试剂，以10% NaOH溶液中和至溶液呈微红色，过滤并定容至25 mL。吸取2mL待测液

11、与10 mL的具塞试管中，准确加入DNS试剂1.5 mL，再用蒸馏水补至3.5 mL，沸水浴中加热5 min，流水冷却，后定溶。在530 nm 处测定吸光度。每次测三个重复，取其平均值。根据测出的吸光度值在葡萄糖标准曲线上查出相应的还原糖值，按下式计算样品中总糖的百分含量：总糖(mg/mL)=查标准曲线所得还原糖浓度×稀释倍数×0.9×100%1.2.6菌丝体生长的动力学方程本试验主要研究黄色须腹菌的菌丝生物量和发酵液中总糖含量随时间的变化，以分批发酵试验为依据，获取发酵液中菌丝体干重和总糖含量数据，进行分批发酵过程动力学模型的初步研究。菌丝体生长动力模型采用 L

12、ogistic方程，基质(底物)消耗模型采用与Luedeking-Piret相似的方程表示 陈坚,堵国成,张东旭.发酵工程实验技术M.北京:化学工业出版社,2009。菌丝体动力学模型方程如下：(1) 式中，k为菌体比生长速率(h-1)；X为菌体生物量(g/L)， Xm为最大菌丝生物量(g/L)；在初始条件下有t=0，X=X0，将上式积分得：(2) X(t)= X0ekt/1-( X0/Xm)(1- ekt)X0为发酵液的初始菌丝体生物量(g/L)，以上方程可以同时表达在对数期和稳定期的菌丝体生长情况。将具体的实验数据代入(2)式，以lnX/(Xm-X)对t作图便得到直线斜率k，截距为lnX0/

13、(Xm-X0)，计算后便能得到X0。1.2.7底物消耗的动力学方程 在发酵过程中底物消耗主要用于菌体生长及代谢。故此底物消耗速率方程采用Luedeking-Piret方程：(3)式中YX/S为生成菌丝体的干重与完全消耗于菌丝体生长的基质质量之比，m为细胞维持系数(h-1)，S为发酵液中的总糖量(mg)。积分后可以得到：(4) S(t)=S0+X0-X(t)+(Xm/k)ln1-(X0/Xm)(1-ekt)式中S0为发酵液初始总糖量(mg)，X0为发酵液的初始菌丝体生物量(g/L)，Xm为最大菌丝体生物量(g/L)，k为菌体比生长速率(h-1)，代表碳源用于产物积累的得率常数(h-1)。按照公式

14、(4)对发酵过程中可溶性糖的实验数据进行非线性拟合，可得到方程的参数。2结果与分析2.1发酵系统中菌丝生物量和pH的变化菌丝体基本参数动态变化试验结果表明，培养体系中前 24h 菌丝生物量增加不明显，菌丝体生长处于延滞期；然后迅速进入指数生长期，到 120h 时，可增加至 17.5g/L；此后进入稳定期，菌丝体生物量保持稳定，在 132h216h 期间，菌体生物量始终保持在 17.6g/L左右，其中在 192h 时菌体生物量达到最大，此时为 17.8g/L；216h 后，菌丝生物量开始有所下降，进入衰亡期，菌丝出现自溶现象(图1)。图1发酵罐培养过程中pH值和菌丝生物量变化Fig.1 The

15、pH and mycelium biomass of fermentation在发酵罐发酵培养过程中，发酵液pH变化范围为3.06.0左右。培养基自然pH为5.96。在36h内，pH没有明显的变化，36h108h之间pH大幅度下降到接近3.0左右，108h192h之间基本维持在接近3.0的水平左右，192h之后开始缓慢地上升至接近4.0左右。这说明在整个发酵过程中，黄色须腹菌菌丝不断生长代谢时会产生影响pH值变化的酸性物质，使得发酵前期pH值大幅度下降，而发酵中期，也就是菌丝生长的稳定期时，菌丝代谢也变得比较稳定，pH值处于一个相对来说比较平稳的状态，而发酵后期菌丝开始出现自溶现象时，pH值又

16、开始缓慢地升高。2.2动力学模型求解2.2.1菌丝体生长动力学模型发酵系统中菌丝体的生长受菌浓及底物浓度等对其的影响，菌丝体的生长是需要的最终产物，据发酵系统中的菌丝体生物量试验值(如图2)对菌丝生长动力学方程参数进行求解，参数估计值见表1，方差分析见表2：图2 发酵过程中的菌丝生物量试验值Fig.2 Experimental data of mycelium growth in fermentation表1参数估计值及置信区间Tab.1 Parameter estimate and approximate 95% confidence limits参数类型估计值标准误置信区间下限上限k0.1

17、580.01670.1450.167Xm17.960.762316.6719.33表2非线性回归及方差分析Tab.2 non-linear regression and ANOVA变异来源自由度平方和均方F值Sig.组内196.2520.32911399.320.000组间21204.2602.1总计211210.4k的估计值为0.158，95%的置信区间为(0.145，0.167)，Xm的估计值为17.96，95%的置信区间为(16.67，19.33)，将各参数代入公式(2)中，求得菌丝体生长动力学模型为：(5) X(t)= e0.158t/4.94432+0.05568 e0.158t)即

18、黄色须腹菌菌丝体比生长速率为0.158h-1；最大菌丝生物量为17.96g/L。2.2.2基质消耗动力学模型在黄色须腹菌发酵过程中，以葡萄糖为限制性基质，其消耗主要用于菌丝体生长及菌丝体细胞的维持，按照发酵系统中的总糖量试验值(如图1-3)对基质消耗动力学方程参数进行求解，参数估计值见表3，方差分析见表4：图3 发酵过程中总糖量的试验值Fig.3 Experimental data of total sugar in fermentation表3参数估计值及置信区间Tab.3 Parameter estimate and approximate 95% confidence limits参数类

19、型估计值标准误置信区间下限上限0.57940.08960.45360.6785-0.000350.1311-0.002470.00134表4非线性回归及方差分析Tab.4 Non-linear regression and ANOVA变异来源自由度平方和均方F值Sig.组内18204.211.3445319.3260.000组间27011.53505.75总计207215.7的估计值为0.5794，95%的置信区间为(0.4536，0.6785)，的估计值为-0.00035，95%的置信区间为(-0.00247，0.00134)，将各参数代入公式(4)中，求得基质消耗动力学模型为：(6) S(

20、t)=29.61- 0.5794e0.158t/4.9443+0.05568e0.158t)-0.0399×ln0.9889+0.01114e0.158t)即碳源用于积累生产菌丝的得率常数为-0.00035。2.2.3模型验证将得到的发酵动力学模型的拟合值与试验数据进行比较，发现两个模型分别能较好地反应菌丝体生长和基质消耗的动态过程，经两个方程计算的菌丝生物量及总糖量模型值能准确地预测菌丝生物量及总糖量试验值，能很好地调控发酵过程中各参数，以达到最佳发酵状态，结果如图4和图5所示。图4菌丝体生长模型值与试验值的比较Fig.4 Comparison of experimental da

21、ta with calculated data on mycelium growth图5基质消耗动力学模型值与试验值的比较Fig.5 Comparison of kinetics model curve of substrate con-sumption and experimental values结果显示：两曲线拟合度均较好，菌体生长和底物消耗模型的拟合度分别为0.996、0.987。因此该方程能够作为黄色须腹菌菌体生长优化控制的参考依据，在发酵进入稳定期后期，由于生长环境恶劣菌体少量自溶，导致实验值与拟合值在发酵后期有一定的偏差。经过模型公式计算结果与实验实测值比较，最大误差为18.34%，平均误差为8.75%。菌体在前期生长时，底物消耗速度较快；随着进入稳定期，菌体对底物的消耗速度也接近平缓。3结论通过对黄色须腹菌液体发酵过程的分析，应用相关软件对试验数据进行处理计算 代志凯,印遇龙,阮征. 微生物发酵动力学模型及其参数拟合的软件实现J. 计算机与应用化学. 2011(04):437-441，得到了菌丝体生长动力学模型和底物消耗动力学模型及其参数，且模型与试验数据能较好地拟合。说明黄色须腹菌液体发酵过程的两个动力学模型在一定程度上揭示了黄色须腹菌发酵代谢的基本特征，可以用来预测发酵液中菌丝体生物量，判断发酵过程的正常与否。从而对发酵操作参数提出要求，以