应用连锁不平衡检验法进行单纯性先天性心脏病易感基因的初步定位

1、应用连锁不平衡检验法进行单纯性先天性心脏病易感基因的初步定位【摘要】目的将人类单纯性先天性心脏病(congenital heart defect, CHD)易感基因初步定位，为进一步对其克隆奠定基础。方法在胚胎心脏发育调控相关基因HOX基因A簇、B簇所在的染色体区域7p14-15、17q21内选择3个微卫星DNA标记D7S1808、D7S673、D17S791，应用荧光标记聚合酶链反应技术扩增微卫星片段，对39个单纯性CHD核心家系的112名成员进行基因型分析，并进行遗传连锁不平衡检验(transmission disequilibrium test,TDT)。结果D7S1808及D7S673

2、这两个位点TDT检验计算2值分别为31.3(P0.005)和11.12(P0.05)，表明此两位点与CHD分别有非常显著和较显著的相关性，而D17S791位点TDT检验计算2值为6.56(P0.05)，未检出连锁不平衡。结论人类单纯性CHD与HOX A簇基因位点有关，HOX A簇基因可能是CHD的候选基因，从而将CHD易感基因初步定位于HOX A簇基因的染色体区域7p14-15。【关键词】先天性心脏病连锁不平衡检验基因定位 Susceptibility gene location of simple congenital heart defect by transmission disequi

3、librium testZHANG Kaili*,SUN Guifeng, JIN Chunyuan, QIU Guangrong, YUAN Yihua, SUN Kailai.【Abstract】ObjectiveTo locate the susceptibility gene of human simple congenital heart defect(CHD) and provide a sound basis for further gene cloning.MethodsThree short tandem repeats(STRs) in regions of chromos

4、ome 7p14-15, 17q21 where exist Hox gene familys A, B clusters which regulate the embryonic heart development were chosen. Genotypes of 112 members in 39 CHD families were analyzed by amplifying the STR fragments using fluorescence-PCR technique. Then transmission disequilibrium test (TDT) was used t

5、o test the data of genotypes.ResultsStatistical 2 values of D7S1808, D7S673 and D17S791 were 31.3(P0.005), 11.12(P0.05) and 6.65 (P0.05) respectively. These suggest that the former two are associated with CHD, while the latter is not.ConculsionHuman simple CHD is associated with Hox gene A cluster.

6、Hox A gene may be a candidate CHDs susceptive genes. The location of the CHDs susceptive genes is in chromosome 7p14-15.【Key words】Congenital heart defectTransmission disequilibrium testGene location我国目前对先天性心脏病(congenital heart defect, CHD)的研究还限于细胞遗传学、微量元素及孕期环境因素与CHD的关系等方面，从基因水平研究其发病机理尚未见报道。大量的动物实验表

7、明脊椎动物胚胎心脏发育很可能受HOX基因表达调控1。我们通过在人类HOX基因所在染色体区7p14-15、17q21内选择微卫星DNA标记，收集单纯性CHD核心家系进行遗传连锁不平衡检验(transmission dis-equilibrium test, TDT)，将人类单纯性CHD遗传易感基因初步定位，为进一步对其致病基因的精细定位和克隆奠定基础，并为其它先天畸形的发病机理研究提供理论依据和方法。1材料与方法1.1标本来源和DNA制备39个核心家系112位成员，均为中国医科大学附属一院、二院心脏外科提供。所有患者均有典型的临床表现，经心脏超声及手术确诊。取静脉血2ml，枸橼酸钠抗凝，常规酚氯

8、仿提取基因组DNA，-20冰箱冻存备用。1.2微卫星DNA标记物选择染色体7p14-15、17q21的3个微卫星DNA标记进行遗传连锁不平衡检验，其中D7S1808选自CHLC连锁谱，D7S673和D17S791选自GDB，所有PCR引物均由中国科学院上海细胞所合成，各微卫星DNA的引物序列及扩增片段大小如表1。表1用于遗传连锁不平衡检验的微卫星引物Tab 1Primers for transmission disequilibrium testLoci(位点)Primer sequence(引物序列)Amplificationfragment length(扩增片段)Allelenumber

9、s(等位基因数目)D7S1808F:5-cagaacaaacaaatggggag-3226bp7R:5-ccaaataagactcaggacgc-3D7S673F:5-ggggnccttgagaagt-3127bp5R:5-tcccagtcctgtggctac-3D17S791F:5-gttttctccagttattcccc-3196bp5R:5-gctcgtcctttggaagagtt-31.3基因型分析1.3.1荧光标记PCR技术扩增各微卫星DNAPCR扩增按常规方法，在PE-9600型扩增仪上进行，反应体系50l，含有基因组DNA 20ng，2.0mmol/L MgCl2，dNTP各20

10、0mmol/L，0.2mmol/L荧光素标记的dUTP，1Buffer,Taq酶1.25U，引物各0.6mmol/L。循环条件：94变性45秒，53复性1分钟，72延伸1分钟，30个循环。1.3.2酚氯仿抽提法纯化PCR产物PCR产物加水至100l，加100l等体积酚氯仿(即酚、氯仿各50l)振荡混匀，离心10 000r/min 5分钟，去掉有机相后按上法重抽提一次，振荡混匀，离心10 000r/min 5分钟，吸取水相至新Eppendorf管，用10 l 3 mol/L NaAc(pH5.2)和200l 100%乙醇沉淀，离心12 000r/min 20分钟，用70%乙醇漂洗沉淀，真空冷冻浓

11、缩仪真空抽干，加水至原体积。1.3.3ABI PRISMTM 310型遗传分析仪应用GeneScan软件进行自动基因型分析。取适量稀释的1l纯化后扩增产物，0.5l内标GenScan-500及12l甲酰胺混匀。95加热2分钟变性后置于冰中骤冷，在ABI PRISM 310型遗传分析仪上进行毛细管电泳。电泳介质为含6.6 mol/L尿素的3% GeneScan poly-mer，制备如下：称取尿素1.6g，7% GeneScan poly-mer 1.7g，10GeneScan buffer 0.4g，加无菌去离子水至4ml。以15KV电泳18分钟。最后用G S软件进行自动基因型分析。1.3.4

12、进行连锁不平衡检验根据检验公式 Nij为TDT表中父母向子代传递不传递的等位基因数。hj为含j基因的杂合子父母数。步骤概括为：(1)建立TDT表格；(2)公式代数计算；(3)查表检验。2结果2.1GeneScan分析结果如1所示。1GeneScan分析结果AJ为标准物GS-500的片段，对应长度(bp)分别为75、100、139、150、160、200、250、300、340、350，箭头所示双峰代表D17S791位点1对等位基因片段长度(bp)为180、196Fig 1The result of GeneScan analysisA-J is fragments of internal st

13、andard GeneScan-500, the lengths(bp) are 75,100,139,150,160,200,250,300,340,350;the two peaks (arrow) are a pair of alleles at D17S791,the lengths are 180bp, 196bp2.2TDT检验结果由表2可以看出：针对D7S1808位点，TDT检验22(0.005,7)，则P0.005，故认为存在连锁不平衡，提示D7S1808位点与CHD相关，具有非常显著的统计学意义；同样，针对D7S673位点，TDT检验22(0.05,5)，P0.05，也存在连

14、锁不平衡，提示D7S673位点与CHD相关，具有较显著的统计学意义；而对于D17S791位点，TDT检验22(0.05,5)，P0.05，所以不存在连锁不平衡，从而认为D17S791位点与CHD无明显相关性。表2TDT检验结果Tab 2Results of TDTLoci(位点)Degree of freedom(自由度)2P value(P值)D7S1808731.30.005D7S673511.120.05D17S79156.560.053讨论 心脏发育是一个极其复杂的多基因调控过程。它涉及不同时间、不同空间的若干个基因先后表达。近年来，国外有关胚胎发育的基因调控研究取得了初步进展。胚胎早

15、期心脏发育大致经历原始始基形成、原始心管形成、心脏环化、心脏分化成熟、房室分隔及血管重建等几个阶段。这是在一定基因调控下的严格的时空变化过程，如果某个基因发生突变，将造成心脏先天畸形。目前主要是进行鼠、果蝇等动物模型研究并已取得一定成果，发现和鉴定了一些与心脏发育相关的基因，其中最主要的就是同源盒基因(homeobox gene)2，3。国外研究认为同源盒基因是调控胚胎分化的主要基因。同源盒基因最初是在果蝇中发现的，在研究控制果蝇触角及双胸复合体发育的调控因子时，发现其具有一段长约180bp的同源序列。以之为探针，在无脊椎动物、脊椎动物和人类中均发现有同源盒基因，并且在结构排列及功能上具有很大

16、程度的一致性。它所编码的60个氨基酸构成螺旋-转角-螺旋结构的同源结构域，特异性地识别以5-TAAT-3为核心的1012bp的DNA序列，作为转录调控因子发挥作用。通过建立合适的动物模型，已经发现了许多与心脏发育相关的同源盒基因，如Mox-1，HoxA-3(Hox-1.5)，tinman，Nkx2-5/Csx等4-7。这些基因在不同的时间和空间表达，其基因产物的相互作用，在心脏发育中起关键性作用。同源盒基因主要有以下几个大的基因家族：HOX、EMX、PAX以及MSX家族。其中人类HOX基因家族共有38个成员，分为A、B、C、D 4簇，分别位于7号、17号、12号、2号4条染色体的特定区域上8，

17、其成簇排列以及排列次序的保守性对HOX基因行使功能相当重要，但其根本原因尚不清楚。目前对HOX基因的研究已近20年，但以往进行的通常是动物实验，以人为研究对象的很少。大量的动物实验证实HOX基因是脊椎动物胚胎发育及器官形成的主要基因，在转录及翻译的不同阶段行使特定的表达调控，其功能改变直接影响发育，因此很可能是人类先天畸形的候选基因，但到目前为止仅有两种人类先天畸形综合征被证实与之相关。人类单纯性CHD从胚胎发育过程看很可能受HOX基因调控，但二者之间到底是否存在相关性还有待于进一步研究。我们充分利用我国的病源优势，收集单纯性CHD家系进行HOX基因与CHD的相关性研究。实验在HOX基因A簇所

18、在染色体区7p14-15内选择了两个微卫星标记，进行TDT检验。在D7S1808及D7S673两个位点都检出了连锁不平衡的存在，并且结果具有非常显著和较显著的统计学意义。根据染色体基因谱，在染色体7p14-15内，除HOX A簇基因外无与胚胎发育相关基因存在，从而提示HOX A簇基因是单纯性CHD的候选基因；本实验同时在HOX基因B簇所在染色体区17q21内选择了一个微卫星标记D17S791，TDT检验未能证实连锁不平衡的存在，该结果有两种可能的解释：一是HOX B基因与单纯性CHD不相关，另一可能是样本量不够，尚有待于通过增加样本量来进一步证实。根据人类基因与脊椎动物基因高度保守的规律，通过

19、动物实验可以确定CHD的候选基因区。实践证明，在候选区中选择连锁标记进行相关检验，容易获得理想结果，做到有的放矢，避免了不必要的人力及物力的浪费。这为其它复杂疾病的研究提供了可借鉴的方法。本课题受国家自然科学基金(39670402)资助作者单位：110001 沈阳，中国医科大学医学遗传学教研室参考文献1Krumlanf R. Hox gene in vertebrate devlopment. Cell, 1994, 78191-201.2McGinnis W, Krumlauf R. Homeobox genes and axial patterning. Cell, 1992, 68(2)

20、283-302.3Scott MP. Vertebrate homeobox gene nomenclature. Cell, 1992, 71551-553.4Candia AF, Hu J, Crosby J, et al. Mox-1 and Mox-2 define a novel homeobox gene subfamily and differentially expressed during early mesodermal patterning in mouse embryos. Development, 1992, 1161123-1136.5Chisaka O, Capecchi MR. Regionally restricted devlopmental defects rsulting from targeted disruption of the mouse homeobox gene Hox-1.5. Nature, 1991, 350473-479.6Bodmer R. Th