耐盐的地衣芽孢杆菌WX-02的分离及氯化钠在产量和分子水平对聚谷氨酸的别构调节

1、应用生物化学生物(2010) 160:13321340 DOI 10.1007/s12010-009-8681-1 耐盐的地衣芽孢杆菌WX-02的分离及氯化钠在产量和分子水平对聚谷氨酸的别构调节 Xuetuan Wei Zhixia Ji & Shouwen Chen 收稿日期：2009.1.5 录用稿件日期：2009.5.20 网上发稿日期：2009.6.7 Humana Press 2009 摘要摘要 聚谷氨酸生产菌株，地衣芽孢杆菌 WX-02 是从中国的盐碱土中分离出来的(Yingcheng)。通过生理、生物化学和 16S rDNA 序列分析方法， 该菌株被认为是地衣芽孢杆菌。

2、在改良的培养基上通过WX-02来研究氯化钠浓度对聚谷氨酸产量的影响。 研究发现聚谷氨酸的产量受盐浓度诱导，并且当氯化钠浓度为 8%时聚谷氨酸产量(13.86 g/l)最高。同时发现当氯化钠浓度升高时，聚谷氨酸的分子大小降低。这是第一个有关分离和辨认地衣芽孢杆菌中产聚谷氨酸菌株的报告。 这个研究提供了一个通过 WX-02 菌株来控制聚谷氨酸产量和分子大小的方法。 关键词：聚谷氨酸生产菌株、耐盐的、聚谷氨酸、分子量、产量 简介简介 聚谷氨酸是由几种芽孢杆菌产生一种粘性的生物聚合物，包括 D型和 L 型两种谷氨酸衍生物。它是一种溶于水，可食用，能被生物所降解，对人类和环境无害的东西。聚谷氨酸在食品，

3、化妆品，医药行业以及农业上有广泛应用1,2。 一些研究员发现这种生物具有液体培养基的粘度越大聚谷氨酸的产量就越大的内在特质。 然而液体培养基粘度的增加将会导致溶解氧气的体积下降达到氧气的临界点， 将会使聚谷氨酸产量降低3,4。通过在培养基中加氯化钠可以使液体粘度下降5,6。然而，大多数枯草芽孢杆菌在高浓度的盐溶液条件下不能在纳豆初提物上快速生长。当培养基上氯化钠浓度大于 3%，聚谷氨酸产量就会明显下降。因此，耐盐的 B 微生物(chungkookjang)从高盐的韩国大豆培养基中提取来克服这些问题。有趣的是，B 微生物(chungkookjang)能够在25%的盐溶液中生长，并且随着盐浓度下降

4、液体表观粘度也下降，但是当盐浓度从 0.5%上升达 5%聚谷氨酸产量下降 29.5%6；因此，人们对了解氯化钠对聚谷氨酸产量的调节效应就更有兴趣了。B 微生物和地衣芽孢杆菌是产聚谷氨酸最主要的两种菌4-10。据我们所知，分离的耐盐性 B 地衣芽孢杆菌作为产聚谷氨酸的菌株还没有被发现。 当前的工作中， 我们已经从中国的盐碱地中分离并认识了产聚谷氨酸 B 地衣芽孢杆菌(Yingcheng)。而且，一些关于这种菌有利的特性例如盐诱导聚谷氨酸产量和在高盐浓度利用小分子合成聚谷氨酸已经被系统地阐明了。 原料和方法原料和方法 原料 高效液相层析水平制得的磷酸二氢钾、甲醇，其他的化学品是分析纯水平的。 所有

5、的化学品和培养基成分是从中国医药化学试剂有限责任公司获得的。 细菌的分离 将土壤样本放在蒸馏水中蒸煮 10 分钟，然后将得到的悬浮物平铺在改良过的 LB 固体培养基上（每升：10g 蛋白胨，酵母提取液 5g，氯化钠 100g，琼脂 15g,PH7.2)。平板在 37 度条件下培养 72 小时。选取生长良好的菌群接种到含有 5%氯化钠的 50ml 的改良培养基上。（每升：L-谷氨酸 20g，葡萄糖 20g,柠檬酸 12g,NH4Cl 7 g, K2HPO4 0.5 g, MgSO47H2O 0.5 g, FeCl36H2O 0.04 g, CaCl22H2O 0.15 g,MnSO4H2O 0.

6、104 g, pH 6.5), 除了用葡萄糖代替甘油其他成分和E 培养基相同11，然后在 37 度和 200rmp 条件下培养 4 天。 细菌的识别 菌株是通过生理学，生物化学和 16S rDNA 序列分析的方法来鉴别。生理和生物化学的鉴定方法是依据 Bergey 的系统细菌学指南来进行的12。16S rDNA 序列分析方法是根据李和其他人的描述来确定的13。基因组 DNA 通过报道的方法已经被掌握14。16S rDNA应用通用引物得到详述，16sf95 (TGACGAGTGGCGGACGGGTG) 和 16sr394 (CCATGGTGTGACGGGCGGTGTG)。用扩大聚合酶链式反应在9

7、5 度培养 5 分钟，接着在 94 度反应 1 分钟，55 度反应 30 秒，72 度反应 1.5 分钟，最后在 72 度扩展延伸 10 分钟的条件下循环 30 次，PCR 产物通过 PCR 纯化试剂盒的工具进行纯化。核苷酸序列是由 ABI棱镜 370 自动分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)以 16sf95 和 16sr394 为引物终止链的方法测定的。序列相似的菌株从基因库和核苷酸数据库重新获得15。通过多重序列比对软体CLUSTAL W 程序和人工编辑获得的序列与原来的是一致的。生物系统树是通过分子进化遗传分析工具 MEGA4.0 构

8、建的16。 分支节点程序置信度是根据新一代 1000 个重新采样的样品树来推测的。 培养条件培养条件 地衣芽孢杆菌 WX-02 细胞接种到 10ml 的 LB 培养基（每升：蛋白胨 10g， 酵母提取物 5g， 氯化钠 10g， PH7.2） 中。 然后在 37 度， 200rpm的条件下在保温箱中培养 10 小时，被用作种菌培养。对于三角瓶培养，将种菌培养的液体培养基（150ul)接种到 250ml 的含有 50ml 的培养液的三角瓶中并在 37 度，200rpm 的条件下培养 4 天。 生物量的测定生物量的测定 为了监控细胞的生长，每隔一段时间去一定的样品。在 13700 个重力单位和 4

9、的条件下使用带有 R20V 转子的 Himac CR21G 离心机（日本，东京，日立）将从液体培养基中分离的细胞进行离心。细胞干重是通过在 80的条件下把细胞进行风干到一定的恒量来测定的。 聚谷氨酸的提纯聚谷氨酸的提纯 聚谷氨酸的提纯和重新获得是根据 Do 等人的方法来操作的。在液体培养基的PH 值下降到3 时将被分离的细胞在9540 个重力单位的条件下使用带有 R20V 转子的 Himac CR21G 离心机离心 15 分钟。上清液用 NaOH 溶液中和， 倒入 4 升的乙醇中， 然后在 4条件下混合并保存 12 小时，接着在 9540 个重力单位下离心 10 分钟。沉淀溶于蒸馏水中， 其他

10、不溶的成分通过在 13700 个重力单位下离心 10 分钟去除。聚谷氨酸（分子量降低为 3500）原溶液通过在蒸馏水中渗析 24 小时然后冻干用来制备纯净的聚谷氨酸。 聚谷氨酸的测定聚谷氨酸的测定 聚谷氨酸根据报道的方法进行分析18,19。纯净聚谷氨酸可以在 6 mol/L HCl 和 110的条件下 24 小时能水解。水解液用 6 mol/L NaOH 中和，水解液中大量的谷氨酸盐是由安捷伦 1100 高效液相色谱仪(25 cm4.6 mm, 美国安捷伦技术有限公司）利用 C18 硅胶进行测定的。10 毫摩尔每升 KH2PO4 加上 5.0%甲醇（PH2.5）作为流动相，流速为 1.0 ml

11、/min。以规范的标准通过一定保留时间，谷氨酸盐被证实是水解液中唯一的产物，聚谷氨酸的产量就是谷氨酸的量。 聚谷氨酸分子大小的估算聚谷氨酸分子大小的估算 聚谷氨酸的分子大小是通过琼脂糖凝胶电泳来估算的20。 少量纯净的聚谷氨酸（10ul)用 TAE 电泳缓冲液40mmol/L 三异丙醇胺,1mmol/L EDTA,0.14%醋酸在 1.0%的琼脂糖胶在 6 V/cm 的条件下解离 30 分钟。 聚谷氨酸在凝胶上可以通过亚甲基蓝0.23%亚甲基蓝，23%乙醇，0.008%KOH染色 10 分钟成蓝色从而变得直观，随后用水脱色。 液体培养基表观粘度的测定液体培养基表观粘度的测定 液体培养基表观粘度

12、是在含有不同NaCl浓度的ME培养基中来获取最高浓度的聚谷氨酸的情况下用旋转粘度计 NDJ-1（中国上海衡平科学仪器有限责任公司)进行测量。 统计分析统计分析 每个实验必须做三份并且还有三个平行试验作对照。 单向方差分析和 t 测试是用来解释均数差，置信度可达 95%。所有的数据分析是用 6.0 数据分析软件包。 结果与讨论结果与讨论 耐盐性的聚谷氨酸生产菌株的分离 三种耐盐性的聚谷氨酸高产菌株从中国地区（荧城）收集到的盐碱土中得到分离。他们的聚谷氨酸产量高于 10g/l,和一些典型的高产聚谷氨酸的芽孢杆菌差不多18。最好的生产者，WX-02 菌株被挑选用做进一步的研究。 细菌的鉴定细菌的鉴定

13、 表 1 显示的是 WX-02 菌株一些分类学上的特征。WX-02 菌株在固体培养基上的显微照片上的菌落是变化无常的。LB 固体培养基上的菌落粗糙，凹陷的中心区域有折叠并且边缘不规则。大不相同的是，在含有 10%NaCl 的固体培养基上菌落是高粘性的， 表面光滑并且边缘规则。 实验中的 16S rDNA 的大约 1263 个核苷酸序列是交给基因数据库(EU564336)来进行分析的。将这段序列与有关菌株的 16S rDNA 序列进行比较。它与地衣芽孢杆菌 DSM 13 (X68416)的相似度达到 99%。随后构建的生物树（图 1）显示典型性的分离的菌群是紧密联系的生物体。根据这些结果，这种菌

14、被归类为地衣芽孢杆菌。该菌种被保存于中国菌种保藏中心(CCTCC M208065)。 表格 1 WX-02 菌株的生物学特征 属性 表征 属性 表征 革兰氏染色 + D-木糖产酸 + 形状 2-3*0.8-1um 甘露醇产酸 + 孢子形状 + 葡萄糖产气 - 能动性 + 氨酸降解 - 硝酸还原作用 + 苯丙氨酸降解 - 厌氧生长 + 产尿素 + 水解淀粉 + 形成吲哚 + 水解酪蛋白 + 过氧化氢试验 + 水解凝胶 + NaCl（12%）生长 + VP 测试 + PH8.0 生长 + 利用柠檬酸 + PH5.7 生长 + 利用丙酸 + 30生长 + D-葡萄糖产酸 + 50生长 + L-阿拉伯

15、糖产酸 + 55生长 - +：正反应 -：负反应 NaClNaCl 浓度对聚谷氨酸产量的影响浓度对聚谷氨酸产量的影响 NaCl 浓度在最大聚谷氨酸浓度时对细胞干重，聚谷氨酸的容积得率和单位生物量生产率的影响是通过不同浓度的NaCl浓度在ME培养基上培养来研究的。如表 2 所示，尽管细胞生长降低，但聚谷氨酸的产量却随着 NaCl 浓度的升高而升高。 当氯化钠浓度为 8%能得到最高产量为 13.86g/l，和没有加氯化钠的培养基相比产量增加了 5.28 倍。据我所知，目前还没有有关耐盐性地衣芽孢杆菌产聚谷氨酸的报告， 所以耐盐的 WX-02 菌株是地衣芽孢杆菌中第一个产聚谷氨酸的菌株。 尽管耐盐性

16、的 B 微生物可以在含有 25%氯化钠的培养基中生长，但是当氯化钠浓度从 0.5%上升到 5%聚谷氨酸的产量将下降 29.5%，说明氯化钠对耐盐性的的 B 细菌在产聚谷氨酸的过程中有抑制作用。 图 1 系统树是通过测定 16S rDNA 的序列来确定与 WX-02 菌株（编号EU564336）关系相近的生物体而建立的。插入的数字是出版序列的登录号。支持率是建立在 1000 次重复试验的基础上。系统树是通过临近结合的方法建立的。置换一个核苷酸在该图上的比例尺长度为 0.01。 表格 2 氯化钠对分批培养物中单位生物量的细胞干重、聚谷氨酸的收益率及生产率(YP/X)的影响 氯化钠浓度（%） 细胞干

17、重(g/l) 聚谷氨酸产率（g/l） YP/X（g/g） 0 3.420.22 2.160.09 0.610.03 2 3.30.15 2.930.23 0.830.08 4 3.210.13 5.200.14 1.640.04 6 3.040.16 11.200.27 3.850.02 8 2.820.15 13.560.24 4.810.01 10 1.790.05 12.490.22 6.690.11 在烧瓶培养中在培养基中加入不同浓度的氯化钠浓度（0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%），分别测出细胞干重和聚谷氨酸产量，得到最大浓度的聚谷氨酸产量。 YP/X=每克细胞产生的聚谷

18、氨酸克数。结果是三个分离发酵数据的平均数。 因此，地衣芽孢杆菌 WX-02 和 B 细菌的产聚谷氨酸量受氯化钠的影响是不同的。我们认为地衣芽孢杆菌 WX-02 具有处理高盐条件的抑制作用的潜能，可作为聚谷氨酸的工业生产菌株。 图表 2 氯化钠浓度对液体表面粘度的影响。通过在 ME 培养基上加入不同浓度的氯化钠浓度(0%, 2%, 4%, 6%, 8%, and 10%)用于三角瓶培养，分别测量液体培养基的表面粘度直到获得最大的聚谷氨酸浓度。 最终结果是三个分开发酵试验的平均数。 图表 2 显示的是当盐浓度达到 8%时聚谷氨酸产量最高时液体培养基的表观粘度。这说明氯化钠影响，降低液体表观粘度和增

19、加溶氧体积在我们的试验中不是唯一至关重要的影响因素。 还有其他影响氯化钠效应的关键因素。 根据 Stanley 和 Lazazzera 的 B 细菌 RO-FF-1产聚谷氨酸的诱导物报告， 两个调节物ComPA 和DegSU可以激活degQ的转录，从而激活负责聚谷氨酸生物合成的 ywsC 操纵子的转录。有趣的是，高盐浓度可以激活 B. subtilis QB4256 中的 DegSU 基因转录。因此，高盐浓度有可能激活 ywsC 操纵子的转录最终提升聚谷氨酸的产量。这也许是氯化钠效应的主要原因。这些结果说明地衣芽孢杆菌 WX-02 产聚谷氨酸是受盐诱导的。 当盐浓度上升时单位生物量的聚谷氨酸产

20、量(YP/X)是增强的， 说明地衣芽孢杆菌 WX-02 处于高渗透压下为了增加存活率而合成聚谷氨酸。-聚谷氨酸可以帮助地衣芽孢杆菌 WX-02 在严重脱水情况下利用自身强大的水结合能力使其处于水结合状态19。 这说明从地衣芽孢杆菌 WX-02 分离得到的聚谷氨酸可能具有结合水的能力23。 图 3 盐浓度对聚谷氨酸分子大小的影响。在 ME 培养基中加入不同浓度的氯化钠进行培养将聚谷氨酸分别纯化后得到最大产量。 然后将聚谷氨酸用亚甲基蓝染成蓝色再进行琼脂糖凝胶电泳。 每条带分别对应的是在聚谷氨酸中加入的氯化钠的浓度 ： a(0%) b(2%) c(4%) d(6%) e(8%) f(10%) 盐浓

21、度对聚谷氨酸分子大小的影响 图表 3 显示的是盐浓度对聚谷氨酸分子大小的影响。 当盐浓度增加分子的大小降低。不同大小的聚谷氨酸有不同的用途。控制合成聚谷氨酸的分子量大小对其应用是至关重要的24。 现在的工作是找到一种简单的方法来生产不同分子量的聚谷氨酸。 氯化钠浓度对不同的芽孢杆菌生产聚谷氨酸的分子大小不同3,6,18。 氯化钠引起不同的芽孢杆菌生产的聚谷氨酸分子大小不同的机理仍然是不太清楚的。 当前的研究侧重于氯化钠对聚谷氨酸的影响和找到一种生物用来以后研究氯化钠对聚谷氨酸分子量大小。 结论结论 地衣芽孢杆菌 WX-02 产聚谷氨酸是受盐诱导的，当盐浓度为 8%时获得最大的产量并且当 ME

22、培养基中盐浓度增高时分子大小会降低。 这些结果显示 WX-02 是第一个耐盐性的产聚谷氨酸的地衣芽孢杆菌，同时也是用过氯化钠调节聚谷氨酸产量和分子大小的宝贵的菌种。 感谢感谢 这项工作是在中国大学杰出人才项目（no. NCET-07-0341）和中国国家高科技研究和发展项目(no. 2008AA10Z317)的支持下完成的。 参考文献参考文献 1. Buescher, J. M., & Margaritis, A. (2007). Microbial biosynthesis of polyglutamic acid biopolymer and applications in the

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