干细胞因子对人乳牙牙髓干细胞生物学活性的影响

1、干细胞因子对人乳牙牙髓干细胞生物学活性的影响    干细胞因子对人乳牙牙髓干细胞生物学活性的影响#路娟英1，高杰2，麻丹丹2，陈婷2*基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20094433120004）作者简介：路娟英，（1973-），女，主治医师通信联系人：高杰，（1974-），男，副主任医师，主要研究方向为牙髓生物学与牙齿再生发育生物学. E-mail: 0 引言乳牙牙髓干细胞（SHED）作为组织工程重要的种子细胞之一，干细胞因子对其作用如45 何，尚不清楚。本实验通过了解干细胞因子对人SHED 增殖与分化能力的影响，为进一步探

2、索干细胞因子在牙齿再生中的作用提供实验依据。1 材料和仪器1.1 主要试剂和仪器DMEM 培养基、胎牛血清、型胶原酶、胰蛋白酶、Trizol（美国Gibco）；维生素C、50 IBMX、胰岛素、地塞米松、-磷酸甘油钠（Sigma 公司，美国）；四氮唑盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、平底6 孔培养板（Nunc 公司，美国）；倒置相差显微镜及照相系统（Olympus 公司，日本）；流式细胞分析仪（Coulter 公司，美国）；70 m 细胞筛网（Falcon公司，美国）；酶标仪，实时荧光定量PCR 扩增仪，SYBR Green 染料（Bio-RAD，美国）；碱性磷酸酶试剂盒，骨涎蛋白，骨钙素

3、，GAPDH 引物（Takara 公司）；干细胞因子（美国55 Santa Cruz 公司）。1.2 SHED 的培养与纯化收集因滞留而拔除的乳牙，牙齿表面灭菌处理，无菌条件下取出牙髓，剪碎，参照文献1报道用0.3%型胶原酶37 消化40 min，轻轻吹打，用70 m 细胞筛网将获得的乳牙牙髓细胞制成单细胞悬液，接种于96 孔板（1 或2 个细胞/孔），常规培养1014 d，待出现60 细胞克隆（以细胞数50 为标准）后扩大培养，待细胞80%汇合后传代培养。培养基为含10%胎牛血清的DMEM，内加100 U/ml 青霉素和100 U/ml 链霉素；37 ，5% CO2 孵箱培养。1.3 MTT

4、 检测取第3 代生长良好的SHED 以5×103/孔接种于96 孔板，每组12 孔，37 、5% CO2 下65 培养24 h 后，每孔分别加入含0、3、10 mol/L 干细胞因子培养液，分别培养1、3、5、7 d后，加入MTT 液20 l，继续培养4 h，弃上清，加入DMSO 150 l /孔，孵育30 min，微振荡10 min，使结晶物充分溶解。490 nm 酶标仪测各孔吸光度（OD）值。实验重复3 次。1.4 碱性磷酸酶（ALP）活性将生长状态良好的SHED 以5×103/孔密度接种于96 孔板内，培养24 h 待细胞贴壁后加70 入含0、3、10 mol/L 干

5、细胞因子培养液，培养1、3、7、14 d 后，按照ALP 试剂盒说明操作，520 nm 处酶标仪测各孔吸光度（OD）值，检测细胞ALP 活性。1.5 RT-PCR用含0、3、10 mol/L 干细胞因子培养液分别培养SHED 7 d 后，按照Trizol 试剂盒说明书提取细胞总RNA，Superscrip逆转录酶合成cDNA 模板。引物由上海生工合成。PCR75 引物序列见表1。RT-PCR 反应体系：共25 l，上游引物1 l，下游引物1 l，SYBR 12.5 l，cDNA 2 l，水8.5 l。反应参数：95 30 s，95 10 s，64 30 s，35 个循环，最后1个循环结束后做熔

6、解曲线，确定PCR 反应质量2，GAPDH 为内参，并设置无模板阴性对照。RT-PCR 反应结束后，利用PCR 扩增仪自带软件进行荧光定量分析，得出Ct 值，绘制 标准曲线。确定骨涎蛋白、骨钙素的mRNA 含量。比较对照组、3、10 mol/L 干细胞因子80 组SHED 的骨涎蛋白、骨钙素mRNA 含量的差异。表1 PCR 引物序列Tab. 1 PCR primer sequence基因 引物序列骨涎蛋白 F 5'-ACAGCTGACGCGGGAAAGTTG-3'R 5'-ACCTGCTCATTTTCATCCACTTC-3'骨钙素 F 5'-

7、ATGAGGACCCTCTCTCTGCTC-3'R 5'-CTAAACGGTGGTGCCATAGAT-3'GAPDH F 5'-GACAACTTTGGCATCGTGGA-3'；R 5'-ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3'85 1.6 统计分析采用SPSS 11.0 软件完成统计处理，采用方差分析，两两比较用SNK 法，P<0.05 为有显著性差异。2 结果SHED 生长情况 细胞以单细胞方式生长，体积均较小，表现为多形性特点，大多数为90 长梭形或多角形，亦有细胞呈现出立方形或多角形（图1）。胞体丰满，胞质均匀。原代培养

8、10 d 基本汇合即可传代，以后平均56 d 传代1 次。图1 体外培养的人SHED（第3代）（×40）Figure 1：Cultured SHED in vitro(×40)95干细胞因子对人SHED 增殖能力的影响： MTT 结果显示，干细胞因子具有促进SHED增殖的能力，随着浓度增加，促进作用逐渐增强，10 mol/L 干细胞因子组对细胞增殖能力的促进作用最强。在刺激1、3、57 d 时，3、10 mol/L 干细胞因子组对SHED 的增殖作用组间比较均具有显著性差异（P<0.05，图2）。100图2 干细胞因子对SHED 增殖能力的影响Figure2：MTT

9、results of SHED effected by stem cell factor干细胞因子对人SHED ALP 活性的影响：不同浓度干细胞因子均可增强SHED ALP 活105 性。其中浓度为10 mol/L 干细胞因子对SHED ALP 活性的促进作用最大，与其他组相比具 有显著性差异（P<0.05，图3）。随着培养时间的延长，差异越来越显著。图3 干细胞因子对SHED ALP 活性的影响Figure3：ALP activities of SHED effected by stem cell factor110干细胞因子对人SHED 中骨涎蛋白和骨钙素mRNA 含量的

10、影响：RT-PCR 结果显示，不同浓度干细胞因子均可促进SHED 中骨涎蛋白及骨钙素mRNA 表达，随干细胞因子浓度增加，促进作用逐渐增强（图4）。115 图4 干细胞因子对SHED 内骨钙素mRNA 表达量的影响Figure4：expression of OC mRNA in SHED effected by stem cell factor3 讨论牙齿组织工程的种子细胞一直是近年来的研究热点。Gronthos 等3首次从人健康第3120 磨牙的牙髓中分离到了具有克隆形成能力、高度增殖能力、多向分化能力的细胞，并命名为牙髓干细胞（DPSC）。现在常用的5 种牙源性干细胞包括成人牙髓干细胞（D

11、PSC）、乳牙牙髓干细胞（SHED）、牙周膜干细胞（PDLSC）、根尖乳头干细胞（SCAP）和牙囊祖细胞（DFPC）4。2003 年，Miura 等1首次在人脱落的乳牙中发现了一种多潜能干细胞，将其命名为SHED，SHED 作为组织工程重要的种子细胞之一，具有增殖能力强，自我更新及125 多向分化能力；而且SHED 较恒牙牙髓干细胞具有更强的增殖、矿化能力；最重要的是SHED易于获取。因此，SHED 的发现为组织工程化牙齿的构建提供了更好的种子细胞。干细胞因子及其受体c-kit 对于人体内多种细胞的分化、增殖和生存起着重要作用5。受体c-kit 是一种酪氨酸激酶受体，其配体干细胞因子通过形成二

12、聚体来发挥信号转导功能，从而实现对间充质干细胞及神经干细胞的迁移和增殖的促进作用6。研究表明，干细胞因子可以促进软130 骨细胞、骨髓基质干细胞的增殖与分化7。研究表明，干细胞因子/c-kit 信号转导通路异常激活，可能导致各类细胞的异常增殖，这对于肿瘤的发病机制和诊断具有一定的指导意义。特别是干细胞因子对成体干细胞的生长具有明显的促进增殖、抑制凋亡作用8，因此对成体干细胞的分化、增殖能够起到调控作用。本实验通过MTT 法检测了浓度为3、10 mol/L 干细胞因子对SHED 增殖能力的影响。135 结果表明，两种浓度的干细胞因子对SHED 增殖均有一定的促进作用，且表现出随浓度增 

13、加刺激作用增强的趋势。10 mol/L 干细胞因子对SHED 的促进作用明显高于3 mol/L，且在第7 天达到高峰。ALP 活性是成骨样细胞分化成熟的重要指标，其活性高低可以反映不同组织、细胞的矿化能力以及向成骨方向转化的趋势9。本实验结果显示，干细胞因子可以增强SHED 的140 ALP 活性，且随着时间延长，以及浓度增加，刺激作用逐渐增强。矿化能力是成骨的干细胞的重要特性之一，骨涎蛋白、骨钙素作为矿化组织的重要检测指标，是在细胞分化的不同时期合成和分泌的，可以直接反映SHED 的矿化成牙能力。本实验用RT-PCR 方法检测了不同浓度干细胞因子对SHED 内骨涎蛋白及骨钙素mRNA 表达的变化