生物化学4抗体制药

1、第四章 抗体制药4.1 概述4.2 单克隆抗体4.3 基因工程抗体4.4 多功能抗体4.5 抗体库技术4.6 抗体诊断试剂4.7 抗体治疗药物 4.1 概述 抗体（抗体（antibody）： 能与相应能与相应抗原抗原特异性结合的免疫球蛋白特异性结合的免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。）。 抗体通过以下途径抗体通过以下途径中和中和和和除去除去有害物质：有害物质：n直接使抗原失去活性直接使抗原失去活性n促使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏促使免疫效应细胞将其吞噬并加以破坏n使抗原表面弱化而易于受补体破坏使抗原表面弱化而易于受补体破坏结晶片段结晶片段Fragment crystalli

2、zableIgM, IgG, IgA, IgD, IgE抗原结合片段抗原结合片段fragment of antigen binding110aa 抗体研究的抗体研究的3 3个阶段：个阶段： 1 1、多克隆抗体、多克隆抗体n含针对多个不同抗原决定簇的含针对多个不同抗原决定簇的不同抗体不同抗体n不同淋巴细胞产生、针对同一不同淋巴细胞产生、针对同一抗原区存在多种抗体抗原区存在多种抗体 中和外源性毒素（蛇毒、白喉毒中和外源性毒素（蛇毒、白喉毒素）素） 非特异性交叉反应非特异性交叉反应不能应用肿不能应用肿瘤和其他疾病治疗。瘤和其他疾病治疗。 2 2、单克隆抗体（、单克隆抗体（ monoclonal an

3、tibody ，McAbMcAb）n仅识别单一抗原决定簇仅识别单一抗原决定簇n由同一细胞产生由同一细胞产生 高度特异性、均一性、来源稳定可高度特异性、均一性、来源稳定可大量生产。大量生产。McAb（ monoclonal antibody ）在临床在临床上主要用于诊断和治疗：上主要用于诊断和治疗：n疾病的诊断疾病的诊断 检测某疾病相关的抗原（检测某疾病相关的抗原（ELISA）n治疗治疗 抑制器官移植排斥（抗分化抗原抑制器官移植排斥（抗分化抗原CD3 单抗）单抗） 作为药物载体对肿瘤进行定向治疗作为药物载体对肿瘤进行定向治疗 McAbMcAb 在免疫导向疗法中存在的问题（障碍）：在免疫导向疗法中

4、存在的问题（障碍）： A、鼠源性，产生人抗鼠抗体（鼠源性，产生人抗鼠抗体（HAMA，human antimouse antibody），），排斥反应，半衰期短排斥反应，半衰期短，难维难维持有效药物作用靶组织时间；持有效药物作用靶组织时间； B、相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。不到有效的治疗浓度。 需要解决的问题需要解决的问题A、降低降低McAb的免疫源性的免疫源性B、降低降低McAb的相对分子质量的相对分子质量3、基因工程抗体、基因工程抗体 人源化抗体人源化抗体（嵌合抗体，（嵌合抗体，chimeric antibody；改

5、形抗改形抗体，体，reshaping antibody；等）等） 基因工程抗体片断基因工程抗体片断（单链抗体，（单链抗体，scFv，single chain antibody；单域抗体单域抗体VH或或VL等）等） 抗体片断只保留了与抗原特异结合的能力，抗体片断只保留了与抗原特异结合的能力，Fc片断片断所具有的所具有的补体激活、免疫调理补体激活、免疫调理等各种生物功能丧失。等各种生物功能丧失。 4.2 单克隆抗体 McAb是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的抗体。一、抗原与动物免疫一、抗原与动物免疫 抗原：抗原： 种

6、类上无限制（种类上无限制（纯化分子、病毒、细菌、细胞等纯化分子、病毒、细菌、细胞等） 纯度无绝对要求（纯度无绝对要求（尽可能高纯度抗原尽可能高纯度抗原） 动物：动物： 骨髓瘤细胞系同品系动物（骨髓瘤细胞系同品系动物（BALB/c小鼠和小鼠和Lou大鼠大鼠） 免疫方法：免疫方法：体内免疫体内免疫 皮下、肌肉及腹腔免疫皮下、肌肉及腹腔免疫 颗粒性抗原（无需佐剂）颗粒性抗原（无需佐剂） 可溶性抗原（加佐剂）可溶性抗原（加佐剂） 脾内免疫脾内免疫 手术暴露脾脏，直接注入手术暴露脾脏，直接注入 来源有限、昂贵抗原来源有限、昂贵抗原 免疫效果差免疫效果差体外免疫体外免疫 从脾脏或外周血中分离淋巴细胞，加入

7、抗原共从脾脏或外周血中分离淋巴细胞，加入抗原共培养培养45天。天。 二、二、 细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养细胞融合与杂交瘤细胞的选择培养 骨髓瘤细胞：骨髓瘤细胞： 自身自身不合成不合成或或不分泌不分泌任何免疫球蛋白分子或片断。任何免疫球蛋白分子或片断。 HGPRT-（次黄嘌呤（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶鸟嘌呤磷酸核糖转移酶） 融合过程：融合过程： 取脾细胞（取脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（）与骨髓瘤细胞（2*1073*107）进行混合，在进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释融

8、合液缓慢稀释 。 HAT选择性培养基培养选择性培养基培养 动物细胞核苷酸合成两条途径： 全合成途径、补救合成途径 氨基喋呤（Aminopterine，A）为四氢叶酸的结构类似物，能够和二氢叶酸还原酶（能够将二氢叶酸还原生成四氢叶酸）发生不可逆结合，阻止了四氢叶酸（核苷酸生物合成的甲基供体）的生成。从而阻断了阻断GMP、TMP的生物合成。 GMP、TMP的补救合成途径： GMP可以在HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）的作用下由次黄嘌呤（hypoxanthine，H）合成。 TMP可以在TK(胸苷激酶)的作用下，由胸腺嘧啶（thymine, T）合成。A:氨基喋呤H:次黄嘌呤 T:胸腺嘧

9、啶抗原免疫小鼠HGPRT- 骨髓瘤细胞 PEG脾B细胞HAT培养基选择培养B-瘤（2周）B、B-B、瘤、瘤-瘤、B-瘤瘤细胞无补救途径，同时全合成途径被A阻断，不能存活；B细胞具有补救途径但不能长期存活；B-瘤细胞具有补救途径又可长期存活三、筛选阳性克隆与克隆化三、筛选阳性克隆与克隆化检测方法：免疫酶技术检测方法：免疫酶技术（ELISA常用）、免常用）、免疫荧光技术、放射免疫荧光技术、放射免疫技术疫技术克隆化克隆化 克隆化方法：有限稀释法和软琼脂法。 有限稀释法：杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔板，使每孔中在理论上只含有一个细胞。 软琼脂法：在培养液中加入0.5%的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成

10、小球样团块，培养基为半固体状态，可用吸管吸出，移入96孔板培养。 加入饲养细胞加入饲养细胞 杂交瘤细胞染色体不稳定，易杂交瘤细胞染色体不稳定，易丢失，反复克隆化，丢失，反复克隆化，3 34 4次，次，至各孔至各孔100%100%抗体阳性抗体阳性四四、 杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定1、染色体分析、染色体分析 正常鼠的脾细胞染色体数：40，全部为端着丝粒。 小鼠骨髓瘤细胞染色体：SP2/0细胞为6268，NS-1为5464，大多数为非整倍性，有中部和亚中部着丝点。 杂交瘤细胞的染色体数目： 接近两亲本细胞染色体数目的总和，在结构上多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色

11、体。 染色体数目多且较集中的杂交瘤细胞分泌高效价的抗体；反之，则反2、分泌抗体稳定性分析、分泌抗体稳定性分析 连续传代，检测上清中抗体浓度；连续传代，检测上清中抗体浓度； 一般需一般需3个月。个月。3、Ig类别及亚类鉴别类别及亚类鉴别 羊或兔抗羊或兔抗Ig不同类或亚类的抗体不同类或亚类的抗体 免疫扩散或免疫扩散或ELISA。4、亲和力测试亲和力测试高亲和力：体内应用或检测试剂高亲和力：体内应用或检测试剂低亲和力：亲和层析低亲和力：亲和层析5、抗原识别位点等其他测试、抗原识别位点等其他测试Ig抗IgG1抗体抗IgG2抗体抗IgA抗体抗IgD抗体抗IgE抗体五、五、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的

12、大量制备1、 动物体内诱生法动物体内诱生法 520mg/ml抗体抗体 基本程序：基本程序： 接种前接种前12周，同品系鼠腹腔注射周，同品系鼠腹腔注射0.5ml 降植烷或液降植烷或液体石蜡体石蜡，然后注射，然后注射1*106杂交瘤细胞，杂交瘤细胞，712d便有腹水生便有腹水生成后注射器抽取，离心去细胞沉淀即得单抗腹水成后注射器抽取，离心去细胞沉淀即得单抗腹水，每只每只小鼠可得小鼠可得35ml。 优点：优点：操作简便，比较经济，抗体浓度高，多操作简便，比较经济，抗体浓度高，多用于研究和诊断等一般用途，用于研究和诊断等一般用途，为一般用途单抗制为一般用途单抗制备首选备首选。 缺点：缺点：混有来自小鼠

13、的非特异性抗体，给纯化混有来自小鼠的非特异性抗体，给纯化带来难度。带来难度。2、体外培养法、体外培养法 悬浮培养、微载体培养等动物细胞大规模培养方式悬浮培养、微载体培养等动物细胞大规模培养方式 抗体浓度比动物体内诱生发低抗体浓度比动物体内诱生发低 用于防病治病单抗的工业化生产用于防病治病单抗的工业化生产 最好采用无血清培养最好采用无血清培养六、六、单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 根据根据IgIg的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法的类和亚类以及用途选择不同的纯化方法： 体外诊断试剂体外诊断试剂IgGIgG类类-沉淀处理沉淀处理+ +亲和层析亲和层析 IgMIgM类类-沉淀处理沉淀处理+ +凝

14、胶过滤凝胶过滤 体内诊断试剂或治疗用药体内诊断试剂或治疗用药-亲和层析亲和层析+ +阴离子交换层析阴离子交换层析六、六、单克隆抗体的纯化单克隆抗体的纯化 动物体内诱生法制备的动物体内诱生法制备的McAbMcAb纯化的一般程序：纯化的一般程序： （1）澄清和沉淀处理）澄清和沉淀处理： 1.11.9%正辛酸正辛酸等电点沉淀白蛋白（血清中主要杂蛋白等电点沉淀白蛋白（血清中主要杂蛋白), 再再硫酸铵沉淀硫酸铵沉淀。小鼠腹水小鼠腹水 90%以上的单克隆抗体以上的单克隆抗体 离心力为离心力为1000g离心离心5min离心力离心力20000g高速离心高速离心30min0.2um微孔过滤膜微孔过滤膜 50%饱

15、和硫酸铵沉淀饱和硫酸铵沉淀 （2）分离）分离 凝胶过滤凝胶过滤 用于IgG和IgM类。 Sephadex G 200 3个峰，分子量最高峰为IgM，另外两个峰为 IgG。 抗体回收率5080%，纯度可达95%以上。 阴离子交换层析阴离子交换层析 适用于IgG类的分离纯化。 亲和层析亲和层析 适用于适用于IgG类类 蛋白蛋白A（protein A, 金黄色葡萄球菌）金黄色葡萄球菌） 蛋白蛋白G （protein G，G群链球菌）群链球菌） IgG的的 Fc片断片断 蛋白蛋白A、蛋白蛋白G与不同属来源的抗体结合强度不同与不同属来源的抗体结合强度不同 pH8.0 结合在亲和柱结合在亲和柱 降低降低p

16、H至至2.53之间进行洗脱之间进行洗脱细胞培养液中单抗的浓缩：细胞培养液中单抗的浓缩：离心或过滤离心或过滤 亲和层析亲和层析 IgG 超滤超滤 4.3 基因工程抗体互补性决定区互补性决定区 (CDR，complementarity determinant region)骨架区（骨架区（FR, frame region）Vk1一、嵌合抗体（一、嵌合抗体（chimeric antibody） 将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来的抗体。 免疫原性大幅度降低。 保留抗原结合特异性。构建过程：构建过程： 提取杂交瘤细胞提取杂交瘤细胞mRNA反转录成反转录成cDNA cDNA RT-PCR分别扩

17、增分别扩增 VL、VH 基因基因表达载体共转表达载体共转染骨髓瘤细胞染骨髓瘤细胞分别与人的轻链、分别与人的轻链、重链恒定区基因相连重链恒定区基因相连人人-鼠嵌合鼠嵌合抗体抗体1516aa二、改形抗体（二、改形抗体（reshaping antibody） 抗原结合区域：抗原结合区域： H和和L链链 V区中的互补性决定区区中的互补性决定区 (CDR，complementarity determinant region) 将鼠源性单克隆抗体的将鼠源性单克隆抗体的CDR以外序列替换人以外序列替换人 Ig分子中的序列，分子中的序列，可基本消除免疫原性。可基本消除免疫原性。 改型抗体也称改型抗体也称CDR

18、移植抗体移植抗体 (CDR grafting antibody)。1516aa构建过程：构建过程： 分别分别RT-PCR克隆克隆杂交瘤细胞杂交瘤细胞H、L链可变区基因并链可变区基因并测序测序设计改形抗设计改形抗体可变区基体可变区基因因 化学合成可变区基化学合成可变区基因因表达载体共转表达载体共转染骨髓瘤细胞染骨髓瘤细胞分别与人的轻链、分别与人的轻链、重链恒定区基因相连重链恒定区基因相连改形抗体改形抗体1516aa问题：问题： 抗体亲和力下降抗体亲和力下降原因：原因： 骨架区（骨架区（FR, frame region）影响影响CDR的空间结构的空间结构。提高亲和力：提高亲和力： 从已知人可变区数

19、据库中选择骨架区与鼠抗骨架区同源从已知人可变区数据库中选择骨架区与鼠抗骨架区同源性最高的序列性最高的序列 骨架区内可能影响抗原结合的氨基酸残基替换为鼠抗残骨架区内可能影响抗原结合的氨基酸残基替换为鼠抗残基：基：立体结构数据、结构预测、分子设计推测立体结构数据、结构预测、分子设计推测 合适保留合适保留CDR两侧骨架区序列两侧骨架区序列 大都涉及大都涉及VL、VH相互作用以及与相互作用以及与CDR接触接触 选择性保留可变区选择性保留可变区N末端的数个氨基酸残基末端的数个氨基酸残基 N末端与末端与CDR表面相距很近，可能参与抗原结合表面相距很近，可能参与抗原结合三、镶面抗体（三、镶面抗体（resur

20、facing antibody） 抗体可变区表面暴露的氨基酸残基位置和数量非常保抗体可变区表面暴露的氨基酸残基位置和数量非常保守，不因种属和型别改变。守，不因种属和型别改变。 为免疫原性主要来源为免疫原性主要来源 将鼠抗可变区表面暴露的将鼠抗可变区表面暴露的骨架区氨基酸残基骨架区氨基酸残基改为相应改为相应的人源残基，使可变区表面人源化。的人源残基，使可变区表面人源化。 消除异源性，保持单抗特异性和亲和力。消除异源性，保持单抗特异性和亲和力。四、小分子抗体四、小分子抗体1.Fab片断（片断（fragment of antigen binding） 完整轻链和重链完整轻链和重链Fd段（单价）段（单

21、价） 完整抗体的完整抗体的1/3 木瓜蛋白酶水解抗体木瓜蛋白酶水解抗体 重组方式生产重组方式生产 抗原特异性、制作简单抗原特异性、制作简单 2.Fv与单链抗体（与单链抗体（single chain Fv，ScFv ）（1）Fv （可变区片断）可变区片断） VL、VH非共价键结合（单价）非共价键结合（单价） 完整抗体的完整抗体的1/6 基因工程重组生产基因工程重组生产 易解离易解离（2）ScFv 常用连接肽常用连接肽：(Gly4Ser)3 优点：优点：分子量小（分子量小（1/6），免疫原性低），免疫原性低容易进入瘤体组织容易进入瘤体组织无无Fc，免疫诊断成像清晰，本底低免疫诊断成像清晰，本底低单

22、链容易改造单链容易改造可采用大肠杆菌大量生产可采用大肠杆菌大量生产缺点：缺点：单价，亲和力下降单价，亲和力下降半衰期短，体内清除过快半衰期短，体内清除过快功能单一，仅能与一种抗原结合功能单一，仅能与一种抗原结合可形成可形成scFv二聚体和多聚体二聚体和多聚体3. 单域抗体单域抗体 VH或或VL 仍保留了抗原结合活性仍保留了抗原结合活性 亲和力低亲和力低4. 分子识别单位分子识别单位（MRU，molecular recognition unit） 单个单个 CDR区区 亲和力相当低亲和力相当低4.4 多功能抗体一、双功能抗体一、双功能抗体(bispecific antibody,BsAb) 具有

23、两种抗原结合特性具有两种抗原结合特性主要指主要指双特异性单链抗体双特异性单链抗体( bispecific single-chain Fvs, BsFvs)构建双特异性单链抗体的方式：构建双特异性单链抗体的方式： 末端半胱氨酸残基共价交联末端半胱氨酸残基共价交联 大肠杆菌表达大肠杆菌表达 链间连接肽相连链间连接肽相连 微型抗体微型抗体 利用专门的二聚化结构域将两利用专门的二聚化结构域将两scFv连接成异二聚体连接成异二聚体 亮氨酸拉链亮氨酸拉链（a螺旋每两圈螺旋每两圈7个氨基酸出现一个亮氨酸，位于同一侧）个氨基酸出现一个亮氨酸，位于同一侧） 转录因子转录因子Fos和和Jun蛋白中含亮氨酸拉链，形

24、成稳定蛋白中含亮氨酸拉链，形成稳定Fos-Jun二聚体二聚体 其他二聚体结构：其他二聚体结构：螺旋螺旋-转角转角-螺旋螺旋等等 双体形式双体形式 短连接肽（短连接肽（312aa）: 同一同一scFv分子内分子内VH和和VL内不能内不能配对，只能和另一分子配对，只能和另一分子VH和和VL配对，形成双体分子。配对，形成双体分子。双特异性抗体的应用：双特异性抗体的应用：在免疫诊断中应用在免疫诊断中应用 两两 抗原结合位点分别设计为针对靶抗原和酶分子抗原结合位点分别设计为针对靶抗原和酶分子 可取代酶标抗体可取代酶标抗体 优点：优点： 不需要标记抗体，避免化学交联抗体和酶对蛋白的损伤，生物活不需要标记抗

25、体，避免化学交联抗体和酶对蛋白的损伤，生物活性高，可大量制备，应用方便。性高，可大量制备，应用方便。 例（肝癌等癌症诊断）：例（肝癌等癌症诊断）： 抗辣根过氧化物酶抗辣根过氧化物酶(HRP)-抗甲胎蛋白（抗甲胎蛋白（AFP）双特异性抗体双特异性抗体ELISA 检测检测AFP最低浓度最低浓度5ng/mL在肿瘤放射免疫显像中应用在肿瘤放射免疫显像中应用 一端针对肿瘤细胞表面的抗原一端针对肿瘤细胞表面的抗原 一端能与带放射性核素的半抗原结合一端能与带放射性核素的半抗原结合 二次导向：二次导向： 先注入双特异性抗体定位肿瘤，一定时间后游离抗体被清除先注入双特异性抗体定位肿瘤，一定时间后游离抗体被清除

26、注入放射性核素的半抗原，定位于肿瘤细胞注入放射性核素的半抗原，定位于肿瘤细胞 与常规放射免疫显像比，可提高清晰度和灵敏度与常规放射免疫显像比，可提高清晰度和灵敏度双特异性抗体介导的药物杀伤效应双特异性抗体介导的药物杀伤效应 常规肿瘤导向：常规肿瘤导向： 单抗与化疗药物、毒素或放射性核素偶联单抗与化疗药物、毒素或放射性核素偶联 导致抗体或偶联药物失活导致抗体或偶联药物失活 双特异性抗体双特异性抗体 很好避免这点很好避免这点 双特异性抗体介导的细胞杀伤效应双特异性抗体介导的细胞杀伤效应 一端针对肿瘤细胞表面的抗原一端针对肿瘤细胞表面的抗原 一端针对免疫活性细胞表面的效应分子，活化该细胞一端针对免疫

27、活性细胞表面的效应分子，活化该细胞 二、多功能抗体二、多功能抗体 将将scFv链内连接肽从链内连接肽从12aa减少减少0aa，可形成二聚体、三可形成二聚体、三聚体、四聚体等。聚体、四聚体等。分子量比分子量比scFv大，克服大，克服scFv清除速度过快的缺点清除速度过快的缺点 多价，亲和力增强多价，亲和力增强 成功报道的不多成功报道的不多 三、抗体融合蛋白三、抗体融合蛋白 将目的蛋白基因与抗体或抗体部分片断基因相连表达出来的重组蛋将目的蛋白基因与抗体或抗体部分片断基因相连表达出来的重组蛋白。白。 目的蛋白：目的蛋白： 细胞因子、受体、酶、配体等。细胞因子、受体、酶、配体等。 目的蛋白与抗体或抗体

28、可变区片断（目的蛋白与抗体或抗体可变区片断（ scFv 、 Fab等等）融合）融合 利用抗体的特异性结合，将生物活性靶向至特定部位利用抗体的特异性结合，将生物活性靶向至特定部位 重组免疫毒素：重组免疫毒素：蛋白毒素（蓖麻毒素、白喉毒素等蛋白毒素（蓖麻毒素、白喉毒素等)-抗体片断抗体片断 抗体抗体-细胞因子细胞因子 酶酶-抗体抗体 ：抗体靶向的酶前体药物治疗（抗体靶向的酶前体药物治疗（antibody directed enzyme prodrug therapy，ADEPT） 抗体、酶、前体药物抗体、酶、前体药物 前体药物药物 目的蛋白与抗体恒定区片断目的蛋白与抗体恒定区片断（Fc）融合）融合

29、 Fc片断作用：片断作用：增加蛋白的半衰期增加蛋白的半衰期可利用可利用protein A进行亲和层析进行亲和层析Fc具有补体激活、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等生物活性具有补体激活、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等生物活性CD4-Ig：CD4-Fcr HIV病毒表面糖结合病毒表面糖结合CTLA4-Ig: CTLA4的胞外区的胞外区- Fcr (细胞毒细胞毒T淋巴细胞抗原淋巴细胞抗原4) CTLA4-Ig: CTLA4(细胞毒细胞毒T淋巴细胞抗原淋巴细胞抗原4)的胞外区的胞外区- Fcr 抑制器官移植的免疫排斥反应抑制器官移植的免疫排斥反应 与与B7分子结合分子结合, 阻断阻断T细胞活化的第二信号

30、细胞活化的第二信号 Fc 有利于有利于Protein A纯化，纯化，CTLA4 为免疫球蛋白超家族成员为免疫球蛋白超家族成员,胞胞外段与外段与Ig Fc段结合后能较好维持分子完整性和空间结。段结合后能较好维持分子完整性和空间结。T淋巴细胞CD28CTLA-4B7CTLA4-Ig4.5 抗体库技术 早期用于构建基因工程抗体的抗体基因来源于早期用于构建基因工程抗体的抗体基因来源于杂交瘤细胞，杂交瘤细胞为鼠源且要经过杂交瘤细胞，杂交瘤细胞为鼠源且要经过动物免疫动物免疫、细胞融合、筛选、细胞融合、筛选复杂过程，获得的抗体基因还需复杂过程，获得的抗体基因还需进行改造进行改造。 20世纪世纪90年代，产生

31、抗体库技术。年代，产生抗体库技术。 两大突破：两大突破： PCR出现和发展，使得一套引物可扩增全套免疫球出现和发展，使得一套引物可扩增全套免疫球蛋白可变区基因蛋白可变区基因 利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体利用大肠杆菌成功表达出具有抗原结合功能的抗体分子片断分子片断 抗体库（抗体库（antibody library）技术：技术： 克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，重组到特克隆全套抗体重链和轻链可变区基因，重组到特定原核表达载体中，转化大肠杆菌表达有功能的抗定原核表达载体中，转化大肠杆菌表达有功能的抗体分子片断，通过亲和筛选得到特异性抗体可变区体分子片断，通过亲和筛选得到特异性抗体可

32、变区基因的技术。基因的技术。 经历了经历了组合抗体库、噬菌体抗体库、核糖体展示组合抗体库、噬菌体抗体库、核糖体展示抗体库抗体库3个阶段个阶段。 噬菌体抗体库噬菌体抗体库发展最成熟、应用最广泛。发展最成熟、应用最广泛。 噬菌体抗体库噬菌体抗体库技术是在技术是在噬菌体展噬菌体展示（示（phage display）基础建立的。基础建立的。 丝状噬菌体（丝状噬菌体（M13、fd、f1） P3、P8 N端融合端融合 P3展示系统（展示系统（展示数百氨基酸，展示数百氨基酸，适合筛选高亲和力配体适合筛选高亲和力配体） P8展示系统展示系统 外源基因外源基因插入在特殊的质粒，即插入在特殊的质粒，即噬噬菌粒菌粒

33、上，噬菌粒含上，噬菌粒含质粒和噬菌体的复制质粒和噬菌体的复制起始点起始点，但需要辅助噬菌体提供产生单，但需要辅助噬菌体提供产生单链所必需的蛋白。链所必需的蛋白。 噬菌体的繁殖需要噬菌体的繁殖需要野生型野生型P3、P8蛋蛋白白，也由辅助噬菌体提供，野生型的，也由辅助噬菌体提供，野生型的P3(或或P8蛋白蛋白)和和P3融合蛋白融合蛋白(或或P8融合蛋白融合蛋白)共同组装到噬菌体颗粒的表面。共同组装到噬菌体颗粒的表面。 噬菌体颗粒中单链噬菌体颗粒中单链DNA主要来自于主要来自于带带外源基因的噬菌粒外源基因的噬菌粒。外源基因噬菌体复制子质粒复制子有缺陷的噬菌体复制子P3、P8、P5等蛋白辅助噬菌体P3

34、外源蛋白融合蛋白噬菌体抗体库的构建：噬菌体抗体库的构建： 扩增全套抗体可变区基因扩增全套抗体可变区基因 从人外周血获取从人外周血获取B细胞，提取细胞，提取B细胞细胞mRNA，RT-PCR扩增全套抗体可变区基因扩增全套抗体可变区基因 构建合适的噬菌体表面展示载体构建合适的噬菌体表面展示载体 Fab抗体库展示载体抗体库展示载体 scFv抗体库展示载体抗体库展示载体 转化大肠杆菌转化大肠杆菌Fab抗体库展示载体抗体库展示载体pComb3 周质腔表达周质腔表达P3scFv抗体库展示载体抗体库展示载体pHEN2 周质腔表达周质腔表达琥珀型终止密码子琥珀型终止密码子TAG 琥珀突变琥珀突变 （supE，编

35、码琥珀突变编码琥珀突变 型型tRNA)抑制菌株抑制菌株 谷氨酸谷氨酸噬菌体抗体库的筛选：噬菌体抗体库的筛选：9天可完成天可完成3次筛选次筛选 对目的克隆进行表达和检测对目的克隆进行表达和检测 噬菌体抗体库技术的特点：噬菌体抗体库技术的特点：能包含能包含B B细胞全部克隆，库容量大，可筛选到各种抗体细胞全部克隆，库容量大，可筛选到各种抗体避开了人工免疫和杂交瘤技术，直接获得抗体基因避开了人工免疫和杂交瘤技术，直接获得抗体基因可获得高亲和力的人源化抗体可获得高亲和力的人源化抗体筛选得到的抗体更易于在大肠杆菌中表达筛选得到的抗体更易于在大肠杆菌中表达 噬菌体抗体库为抗体工程发展的一个里程碑。噬菌体抗

36、体库为抗体工程发展的一个里程碑。 成功筛选出大量抗体，有些已经进入临床实验阶段成功筛选出大量抗体，有些已经进入临床实验阶段 噬菌体抗体库还可用于抗体分子定向进化的筛选噬菌体抗体库还可用于抗体分子定向进化的筛选 新型抗体库技术：新型抗体库技术： 选择性感染噬菌体展示抗体库技术选择性感染噬菌体展示抗体库技术 核糖体展示抗体库技术核糖体展示抗体库技术4.6 抗体诊断试剂 抗体诊断药物基本分为三类：抗体诊断药物基本分为三类：n血清学鉴定用的抗体试剂血清学鉴定用的抗体试剂n免疫标记技术用的抗体试剂免疫标记技术用的抗体试剂n体内导向诊断药物体内导向诊断药物 一、血清学鉴定用的抗体试剂一、血清学鉴定用的抗体

37、试剂 血清学鉴定：血清学鉴定： 用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病用已知抗体来鉴定未知的抗原型，主要用于疾病的病原菌诊断和血型鉴定。原菌诊断和血型鉴定。 基本原理：基本原理： 抗体与抗原之间的凝集反应抗体与抗原之间的凝集反应（1）鉴定病原菌用的抗体试剂）鉴定病原菌用的抗体试剂 诊断血清诊断血清162种（2）乙型肝炎病毒表面抗原（）乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的的反向被动血凝诊断反向被动血凝诊断试剂试剂 灵敏度与酶免疫测定法相同，操作简便快速。灵敏度与酶免疫测定法相同，操作简便快速。（3）妊娠诊断试剂）妊娠诊断试剂 检测血液和尿液中的检测血液和尿液中的绒毛膜促性腺激素绒毛膜促性

38、腺激素HCG。（4）抗）抗ABO血型系统血清血型系统血清 红细胞表面存在红细胞表面存在A或或B凝集原，鉴定血型凝集原，鉴定血型二、二、免疫标记技术用的抗体类试剂免疫标记技术用的抗体类试剂n荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂n酶免疫测定用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂n放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂（1）荧光抗体诊断试剂荧光抗体诊断试剂 荧光抗体荧光抗体: 荧光色素荧光色素, 如如异硫氰酸荧光素（异硫氰酸荧光素（FITC）、）、罗丹罗丹明（明（RB200）、）、藻红素（藻红素（PE）等标记抗体蛋白而成等标记抗体蛋白而成。 主要用于组织内或细胞内抗原物质的主要用于组织内或细胞内抗

39、原物质的定位测定定位测定： 用荧光抗体浸染含有抗原物质的用荧光抗体浸染含有抗原物质的组织切片或细胞组织切片或细胞，荧光抗体与抗原结合，在荧光抗体与抗原结合，在荧光显微镜荧光显微镜下成为发光的可视下成为发光的可视物，达到诊断和定位目的。物，达到诊断和定位目的。直接法直接法: 荧光抗体直接与抗原反应，抗原鉴定、定位和分布。荧光抗体直接与抗原反应，抗原鉴定、定位和分布。 需要制备所需检测抗原的相应抗体。需要制备所需检测抗原的相应抗体。 荧光荧光CD单克隆抗体：单克隆抗体： 白细胞分化抗原（表面标志）：白细胞分化抗原（表面标志）： CD（分化群，分化群，cluster of differentiati

40、on），），按发现先后编号（按发现先后编号（1247） 相应的相应的CD抗原的抗原的荧光标记单克隆抗体荧光标记单克隆抗体用于细胞的鉴定、分离。用于细胞的鉴定、分离。间接法间接法 标记标记抗免疫球蛋白抗体抗免疫球蛋白抗体（二抗、抗抗体）（二抗、抗抗体） 标记一种抗体，可检测多种抗原抗体系统标记一种抗体，可检测多种抗原抗体系统，灵敏度比直接法高灵敏度比直接法高510倍。倍。 根据一抗不同，二抗根据一抗不同，二抗 种类不同：羊抗兔抗体、羊抗人抗体等。种类不同：羊抗兔抗体、羊抗人抗体等。（2）酶免疫测定用抗体诊断试剂酶免疫测定用抗体诊断试剂 用酶标记抗体来检测抗原或抗体，酶的显色反应。用酶标记抗体来检

41、测抗原或抗体，酶的显色反应。 常用酶：常用酶：辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶( (HRP)HRP)、碱性磷酸酶碱性磷酸酶( (AP)AP)等。等。 标记抗体：标记抗体：一抗或二抗一抗或二抗 分类：分类：免疫酶染色（组化法）免疫酶染色（组化法）和和酶免疫测定酶免疫测定 免疫酶染色免疫酶染色（组化法）（组化法） 用于组织内抗原物质的用于组织内抗原物质的定位测定定位测定。 酶标（酶标（辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶，HRPHRP ）抗体与抗原发生特异）抗体与抗原发生特异性结合，性结合， HRPHRP催化底物催化底物二氨基联苯胺（二氨基联苯胺（DABDAB）生成棕褐生成棕褐色沉淀物色沉淀物, ,标本的抗

42、原部位显色，光学显微镜下观察。标本的抗原部位显色，光学显微镜下观察。 酶免疫测定（酶免疫测定（定量测定定量测定溶液溶液中抗原中抗原或抗体浓度或抗体浓度） 抗原抗体结合后，抗原抗体结合后，分离结合物分离结合物，利用所标记酶将底物转化为有色产利用所标记酶将底物转化为有色产物，使用分光光度进行测定。物，使用分光光度进行测定。 ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay, 酶联免疫吸酶联免疫吸附试验附试验）：）： 抗原或抗体吸附于聚苯乙烯塑料表面，抗原抗体在塑料抗原或抗体吸附于聚苯乙烯塑料表面，抗原抗体在塑料表面进行表面进行, 非结合抗原或抗体容易洗去，简化抗原抗体

43、结合非结合抗原或抗体容易洗去，简化抗原抗体结合物的分离。物的分离。 ELISA灵敏度灵敏度ng/ml 基本方法：基本方法：夹心法、间接法、竞争法夹心法、间接法、竞争法。 间接法（测抗体）间接法（测抗体） 夹心法（测多价抗原）夹心法（测多价抗原）竞争法竞争法(可测单价抗原可测单价抗原)生物素生物素-亲和素放大亲和素放大ELISA (biotin-avidin system-ELISA，BAS-ELISA)生物素（维生素生物素（维生素H）亲和素（亲和素（avidin，碱性糖蛋白，鸡蛋清提取）碱性糖蛋白，鸡蛋清提取）链菌亲和素（链菌亲和素（streptavidin，链霉菌培养液提纯）链霉菌培养液提纯

44、）亲和力亲和力: biotin-avidin 比抗原比抗原-抗体高抗体高1万倍万倍采用采用生物素化抗体生物素化抗体替代替代酶标抗体酶标抗体一个抗体可结合一个抗体可结合90个生物素个生物素一个亲和素结合一个亲和素结合4个个生物素生物素生物素或亲和素与生物素或亲和素与酶偶联酶偶联灵敏度灵敏度 pg/ml HBsAg(乙型肝炎表面抗原乙型肝炎表面抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 HBeAg(乙型肝炎乙型肝炎e抗原抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 HAVAg(甲型肝炎病毒抗原甲型肝炎病毒抗原)酶标诊断试剂酶标诊断试剂 测定测定HIV（人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂人免疫缺陷病毒）抗原的酶标诊断试剂 A

45、FP（甲胎蛋白）酶标诊断试剂甲胎蛋白）酶标诊断试剂 CEA（癌胚抗原）酶标诊断试剂癌胚抗原）酶标诊断试剂（3）放射免疫用抗体诊断试剂放射免疫用抗体诊断试剂 抗体或抗原采用同位素标记，通过测定放射量测抗体或抗原采用同位素标记，通过测定放射量测定浓度。定浓度。 常用常用125I 测定方法与测定方法与ELISAELISA相同（相同（夹心法、间接法、竞争夹心法、间接法、竞争法法），检测方法不同），检测方法不同 灵敏度高灵敏度高pg/mlng/ml 放射性对人有害，需防护措施放射性对人有害，需防护措施 标记物半衰期短标记物半衰期短 检测仪器昂贵检测仪器昂贵 三、导向诊断药物三、导向诊断药物 肿瘤放射免疫

46、显像肿瘤放射免疫显像 抗肿瘤单抗（抗肿瘤单抗（Ab）与与 二乙基三胺五乙酸（二乙基三胺五乙酸（DTPA）偶联成偶联成Ab-DTPA Ab-DTPA注入体内与肿瘤结合（注入体内与肿瘤结合（3d） 注入注入In-113 (铟铟) ，与，与DTPA络合显像（络合显像（2h）4.7 抗体治疗药物抗体治疗药物 一、抗体一、抗体封闭类抗体封闭类抗体 与抗原结合，封闭抗原生物活性，阻断其与其他蛋与抗原结合，封闭抗原生物活性，阻断其与其他蛋白或配基作用。白或配基作用。 如：如： 封闭各种细胞因子，破坏信号传导通路封闭各种细胞因子，破坏信号传导通路 效应杀伤类抗体效应杀伤类抗体 与抗原结合后，通过与抗原结合后，通过Fc片断介导的生物学功能清除片断介导的生物学功能清除或杀伤抗原物质（如肿瘤细胞、自身免疫细胞）或杀伤抗原物质（如肿瘤细胞、自身免疫细胞） 二、以抗体为载体的导向治疗药物二、以抗体为载体的导向治疗药物导向载体：导向载体： 抗体、小分子抗体片断抗体、小分子抗体片断如