动物寄生虫病PCR诊断技术

1、动物寄生虫病PCR诊断技术聚合酶链反响 Polymerase Chain Reaction, PCR 技术是一种既敏感又特异的 DNA 体外扩增方法， 它可将一小段目的 DNA 扩增上百万倍，其扩增效率使得该方法可检测到单个虫体或仅局部虫体的微量 DNA 。通过设计种、 株特异的引物， 此法只扩增出种、 株特异的 PCR 产物， 具有很高的特异性。 而且 PCR 技术的操作过程也相对简便快捷，无需对病原进行别离纯化；同时可以克服抗原和抗体持续存在的干扰， 直接检测到病原体的 DNA ，既可用于虫种、株的鉴别，动物寄生虫病的临床诊断，又可用于动物寄生虫 病的分子流行病学调查。随着 PCR技术的不

2、断完善与开展，它已广泛应用于分子生物学、生物技术、临床 医学等各个领域，具有广泛的应用前景。一、实验目的要求掌握PCR诊断技术所涉及实验的根本原理，全面熟悉 PCR诊断技术的操作过程，其中包括寄生虫DNA的提取、PCR引物的设计、PCR条件的优化、对目的片断的扩增、琼脂糖凝胶电泳及结果分析、PCR产物的纯化等等。二、实验仪器和材料一寄生虫基因组 DNA的提取及纯化1. 虫体材料。 单个虫体。2. 器具。 超净工作台、 恒温培养箱、 TGL-16G 高速台式离心机、 旋涡振荡器、 微量取液器及配套吸头、 微量离心管、一次性注射器、微型眼科镊、微型眼科剪刀、玻璃平皿、滴管、有机架等。 乙二胺四乙酸

3、Ethyle ne diami netetra acetic acid , EDTA、十二烷基磺酸钠 Sodium dodecyl sulfate, SDS、三羟甲基氨基甲烷 -盐酸Tri (Hydroxymethyl) Ami no metha ne-HQ Tris-HCI、氯化钠、蛋白酶 K25刚Q、异丙醇80%、双蒸水、灭菌超纯水等。(2) DNA 裂解液：500 mM NaCl 70 lP 100 mM Tris-HCl pH30 卜 50 mM EDTA pH150 Q 10%SDS 30 l。(3) Wizard TM DNA Clean-Up 试剂盒或类似的 DNA 提取试剂盒。

4、二 PCR 扩增及琼脂糖电泳1 材料。 提纯的虫体 DNA 。2 .器具。 超净工作台、微型高速台式离心机、微量取液器2/20/200/1000 qI、PCR扩增仪、琼脂糖电泳系统、凝胶成像系统、微波炉、4 C /-20 C冰箱、紫外透射仪、微型离心管 200/500/1500 Q、有机架、一次性手套、透明胶带、量筒 100 ml、三角瓶500 ml、等。3. 试剂。(1) 10 x PCR Buffer无 Mg2+、dNTP2.5 mM each、ddH?。、MgCI 225 mM、Primers、Ex Taq 酶5 U/ I、琼脂糖、EB 10mg/ml、Tris 碱、硼酸Boric ac

5、id、去离子水、EDTA 0.5 mol/L , pH 8.0、 10x载样缓冲液。x TBE缓冲液：准确秤取 Trisgg，充分溶解于 800 ml去离子水中，加 10ml 0.5 mol/L EDTA pH8.0， 用去离子水定容至 1000ml 。三 PCR 扩增产物的纯化1 .材料。 PCR 扩增产物。2 .器具。TGL-16G高速台式离心机；三用电热恒温水箱；微量取液器2/20/200/1000 Q、琼脂糖电泳系统、微波炉、电子天平、4C /-20C冰箱、紫外透射仪、微型离心管500/1500 Q、有机架、透明 胶带、一次性注射器、量筒 100ml 、三角瓶 500ml 、手术刀、保

6、鲜纸等。X TBE缓冲液；UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；UNIQ-10柱式PCR产物纯化试剂盒；异丙醇80% 等。三、实验方法、步骤和操作要领(一)寄生虫基因组DNA的提取及纯化1. 实验原理。 应根据研究目的来决定是从单个虫体还是多个虫体提取基因组DNA寄生虫虫体的各个部位都可以作为基因组 DNA的抽提材料，如果虫体较大的话可取其中部而保存其头部及尾部，以备形态学 鉴定以验证其种类。如果虫体较小小于 1 cm，那么应使用整条虫体抽取DNA假设虫体特别细小例如幼虫，可用多条虫体来提取 DNA为了获得高含量、高纯度的DNA最好使用新鲜材料。从冻干或50%-70% 乙醇保存的寄生虫材料中也

7、可较容易地提取DNA。寄生虫DNA的抽提方法有多种，不同种类的寄生虫虫体都有其最适合的抽提方法，但各种方法的根本原理都一样，即先用机械的方法将虫体组织破碎，然后参加DNA裂解液和蛋白酶 K,充分作用后，虫体组织中的细胞膜破裂，蛋白质变性，将虫体基因组DNA释放到溶液中。在裂解过程中，虫体细胞碎片及大部分蛋白质会相互缠绕成大型复合物，后者被DNA裂解液中的SDS包盖，通过离心沉淀，这些复合物会从溶液中沉淀下来，变性剂也同时被除去，从而就可从上清中回收虫体基因组DNA溶液。回收后的虫体基因组DNA液用Wizard TM DNA纯化试剂盒进行纯化。纯化时，DNA溶液与纯化试剂盒中的清洗树脂混合后，其

8、混合液在通过微型柱时 DNA会结合在柱上，而其它杂质会通过微型柱排出；再用80%异丙醇进行冲洗，去除剩余杂质。最后，在微型柱中参加预热的TE缓冲液或超纯水，使结合在微型柱上的DNA充分溶解，通过离心，其洗脱液即为纯化的虫体基因组DNA溶液。2实验方法、步骤和操作要领。(1) 虫体材料的处理 ( 假设为新鲜或冻干保存的虫体，那么不需要此步骤 )。ml 的离心管中。假设虫体较小，取一整条虫体经如上洗涤处理。对于鸡球虫，将保存在 2.5%重铬酸钾溶液的卵囊悬液以2000X g离心10min，弃重铬酸钾溶液。以双蒸水重悬，同法离心洗涤三次后，用20%次氯酸钠处理卵囊 20min， 2000X g 离心

9、沉淀卵囊，用适量饱和盐水重悬卵囊沉淀，1500X g离心10min，上清液参加4倍体积的灭菌双蒸水，3000 X g离心10min。卵囊 沉淀再用上述方法重新漂浮、洗涤一次。用少量灭菌双蒸水重悬卵囊沉淀，然后将其轻轻地加在0.6M 无菌蔗糖溶液之上，2000X g离心5min，取上层卵囊加 5倍体积的水，3000 X g离心10min，沉淀再用无菌 蔗糖溶液漂浮一次，即可得纯洁的卵囊，可立即用于裂解以提取DNA。(2) 虫体材料的裂解。用灭菌且经紫外灯照射过的微型眼科剪刀将虫体组织剪碎，参加280讪的SDS裂解缓冲液，轻轻混匀，再参加20讪25呃/认的蛋白酶K溶液。对于原虫如鸡球虫、隐孢子虫，

10、将纯化好的卵囊 3000rpm/min离心10min，去掉大局部上清后参加与卵囊体积相同的玻璃珠，漩涡震荡直到有95%卵囊破壁后，即可参加SDS裂解缓冲液及蛋白酶 K溶液。混匀后，放于恒温培养箱中，37 C作用1248 h，其间不时摇动离心管， 使虫体组织裂解充分。(3) 虫体 DNA 的抽提和纯化。首先进行虫体 DNA提取，然后按Promega公司试剂盒 WizardTM DNA Clean-Up System使用说明对DNA 进行纯化。方法如下： 取出于恒温培养箱中作用了约 20小时的离心管，旋涡震荡器震荡混匀，10000rpm离心2min，上清即为虫体DNA溶液。将上清转移至一新的离心管

11、中，参加1ml清洗树脂按50500讪悬液/1 ml清洗树脂的比例 ，旋涡震荡混匀。 取一支 5ml 的一次性注射器，去针头，拔出注射器内芯推液筒，接上 Wizard TM 微型柱。 将 DNA- 树脂混合液全部转移到注射器中，用注射器内芯推液筒，慢慢地将 DNA- 树脂混合液推过 微型柱，排出废液。 将注射器从微型柱上拔出后，拿去注射器内芯推液筒，再将注射器套在微型柱上，向注射器内加入2 ml柱洗溶液80%的异丙醇，用注射器内芯推液筒慢慢将洗柱液通过微型柱，以洗涤DNA-树脂样品。 拔去注射器，将微型柱套在洁净的1.5ml离心管上，10000rpm离心20sec,以除去残留的异丙醇。 将微型柱

12、从注射器上转移到一新的离心管上，在柱中央参加3050讪预热6070C的超纯水或1 x TE缓冲液，静置1 min , 10000rpm离心20sec。离心管内的液体即为 DNA溶液。可将 DNA溶液转 移至0.5 ml离心管中于-20C冰箱保存备用。二寄生虫 DNA的 PCRT增及琼脂糖电泳1. 实验原理。(1) PCR引物设计。PCR反响成功扩增的一个关键条件在于寡核甘酸引物的正确设计。PCR引物设计的目的是找到一对适宜的寡核甘酸片段，使其能有效地与目的片段两端的序列互补。设计引物时要遵循以 下原那么： 长度不能太长，也不能太短，一般在 18 25 个碱基左右； G+C含量及Tm值：弓I物的

13、G+C含量以40%60%为宜。弓I物的Tm值是指寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下 50%寡核苷酸双链的解链温度。PCR 引物应保持合理的 G+C 含量。含有 50%G+C的20个碱基的引物其 Tm值约界于5662C,这可为有效退火提供足够的温度。由于G+C间的氢键数较A+T 间多，因此， G+C 含量高的 DNA 片段其 Tm 值也高。对于短于 20 个碱基的引物， Tm 值可按 Tm=4(G+C)+2(A+T) 计算。而对于较长的引物， Tm 值的计算较为复杂。 由于 PCR 扩增的特异性取决于两 条引物与相应模板的结合，因此，反响中退火温度应根据两个Tm 值折衷选择。 碱基的组成尽

14、量随机，尽量不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在；尤其是3'末端不应超过 3个连续的 G或 C； 引物内部不应有互补序列，否那么引物自身会折叠形成发夹结构或引物本身复性。这样二级结构会 因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 假设引物自身连续互补碱基达 3个以上， 就容易形成发夹结构。 两个引物之间不能互补，尤其应防止3'末端的互补重叠以防止形成引物二聚体。两个引物不应有4 个以上的碱基连续相同或互补； 引物的 3'末端应与目的片段完全相配。这对于获得好的扩增结果非常重要。如果能确定一个保守 氨基酸，可将其密码子的前 2个碱基作为 3'末端。 引物的 5'末端可不

15、与目的片段互补， 可被修饰而不影响扩增的特异性。 引物的 5'末端修饰包括：加酶切位点，标记生物素、荧光、同位素、地高辛等。还可引入蛋白质结合DNA序列、引入突变位点、引入翻译起始密码子、启动子序列等。所附加的限制性酶切位点应是不会在引物以外的DNA上切割的。为了有效地切割限制性酶切位点，在限制性酶识别序列的5'端常需添加 2-3 个非特异的额外碱基。 假设是设计种或株特异性引物， 引物与非特异序列的相似性不能超过70%或有连续 8个以上的互补碱基相同。可用 DNAstar、 MegAlign 软件比拟相似性，用 Oligo50 来设计引物。(2) PCR的根本原理。在存在DN

16、A模板、弓I物、dNTR适当缓冲液Mg+的反响混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA引物之间的变性，退火复性，延伸三步反响为一周期cycle，循环进行，使目的 DNA片段得以扩增。 由于每一周期所产生的 DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物以指数方式增加，经 30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍。在实际应用中，一般多用3035个循环。(3) 琼脂糖电泳的根本原理。琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，于沸水中溶解，45C开始形成多孔性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带

17、负电荷，在外加电场的作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的DNA其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法别离DNA主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。溴化乙锭EB为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA含量成正比。2. 实验方法、步骤和操作要领。(1) PCR扩增。 先按单倍扩增体系中各试剂的量计算好n倍除去模板DNA量扩增体系中各试剂相对应的量，然后在适合体积的离心管中依次

18、参加试剂如nx 2.5卩I10X PCR Buffer、nx 2 ldNTP , nx 4 卩 MgCI 2、n x 0.5 卩 Forward primer、nx 0.5 卩 Reverse primer、nx 14.4 uldH2O、n x 0.125 卩 lx Taq 酶，最后总体积为 nx 24卩，经离心混匀后，分装至n个200卩的离心管中包括阴阳性对照，在各管中参加模板DNA如扩增体系为25卩那么参加1卩1模板DNA，混匀后于PCR扩增仪中按已设好的 PCR 扩增条件进行扩增。如细胞色素 c氧化酶第一亚基(cytochrome c oxidase subunit 1, cox1基因的

19、扩增体系为：试剂体积卩ddH2O10x PCR BufferMgCl 2 (25 mM)dNTPs (2.5 mM each)2Forward primer (100 pmol/ l, JB3)Reverse primer (100 pmol/ l, JB4.5)Ex Taq (5 U/ l)模板(gDNA)125总量coxI基因的PCR扩增条件:扩增完毕后，取出 PCR扩增产物于4C /-20C冰箱保存备用。94 C变性5 min94 C变性30 s55 C复性30 s30个循环72 C延伸30 s72 C延伸5 min(2)琼脂糖凝胶电泳。制备凝胶：胶浓度视具体情况而定。以配制0.8%琼脂

20、糖凝胶为例，准确称取0.8 g琼脂糖参加至100 x TBE电泳缓冲液，于微波炉中或经高压熔化均匀，冷却至50C左右，参加溴化乙锭EB 10 mg/ml,参加量为8.3 yFB/100 ml琼脂糖凝胶液，混匀后倒入已封好的凝胶灌制胶模中，插上样品梳。待胶凝固 后，从胶模上除去封带，拔出梳子放入电泳槽中，参加足够量的电泳缓冲液要求缓冲液液面高出凝胶外 表约1 mm。 点样：取PCR扩增产物35卩,与适量的加样缓冲液Loading buffer, LB混匀假设为6XLB ,3-5卩扩增产物加1 ylX LB，然后用取液器将样品参加点样孔中，同时设以适宜的DNA分子量标准物marker作为参照。 电

21、泳：接通电极，使 DNA 向阳极移动，在 110 V/cm 凝胶的电压下常用 100 V 进行电泳。当 加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够别离 DNA 片段的距离时，关闭电源。 结果观察：将电泳好的琼脂糖胶置于紫外透射仪中，翻开紫外灯，假设看到橙红色的核酸条带， 那么说明有扩增的 PCR 产物；根据条带粗细，可粗略估计该条带的 DNA 量；根据分子量的标准 DNA 对照，通过线性 DNA 条带的相对位置可初步估计扩增产物的分子量。如果仅出现预期分子量大小的条带 而无非特异性条带，那么说明扩增的特异性较好。如果扩增结果比拟满意，那么用凝胶成像系统进行摄影，保存图像。三PCF扩增产物的纯化1. 实验原

22、理。为验证PCR扩增产物的种或株特异性，往往需对PCR扩增产物进行测序验证。为了建立种、株特异的 PCR诊断技术，需要确定种、株特异的遗传标记。在这样的情况下，往往需要将PCR产物进行纯化， 连接到克隆载体， 转化宿主菌， 然后经菌落 PCR 及限制性内切酶酶切鉴定筛选阳性菌落进行 测序。获得纯度高的 PCR 产物是进行连接、转化、测序的前提条件。 PCR 产物的纯化方法一般有两种： 一种是切胶回收， 另一种是 PCR 产物直接回收。 切胶回收的原理就是通过琼脂糖凝胶电泳， 将要回收的目 的片段从凝胶上切下来， 然后再通过 DNA 胶回收试剂盒进行纯化， 以去除 DNA 样品中除了目的基因片段

23、 外的所有杂质。而 PCR 产物直接回收法那么是将扩增的 PCR 产物直接用 PCR 产物纯化试剂盒进行纯化。 两种方法各有利弊，切胶纯化的纯度较高，但回收率低； PCR 产物直接纯化，回收率高，但纯度较低。如果PCR扩增产物很特异，且引物长度小于60 bp，那么两种方法都可选用，但如果有非特异性条带或引物长度大于 60 bp 时，就必须用切胶纯化的方法。2. 实验方法、步骤和操作要领。1切胶纯化法按生工生物工程上海UNIQ-5柱式DNA交回收试剂盒说明进行： 取4050皿PCR产物于0.8%的琼脂糖凝胶中电泳约4050 min可适当缩短电泳时间以提高回收效率。注意： 必须将电泳槽用自来水充分

24、冲洗， 电泳缓冲液一定要换新鲜干净的， 以保证不会有其它 DNA 污染。 于紫外透射仪中铺上一块新鲜的保鲜纸，将凝胶放在保鲜纸上以尽量提高DNA 回收的纯度 ，翻开长波紫外灯用干净的手术刀快速将目的片段从琼脂糖凝胶上切下来尽可能去除多余的琼脂糖胶。切下来的胶块放入一新鲜、灭菌的 1.5 ml 的离心管中，用电子天平称重并作好记录。 按每100 mg琼脂糖凝胶或100 4的DNA溶液参加400认Binding buffer的量来计算，参加相应体 积的Bin di ng buffer，混匀后置于5060C水浴中10分钟，使胶彻底融化加热融胶时，每 2分钟混匀一 次。 将融化的胶溶液转移到套放于2

25、ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置2 min，用台式离心机高速8000 rpm丨离心1 min。适当降低离心转速有助于提高DNA结合率。 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液， 将 UNIQ-10 柱放回收集管中， 参加 500 4lWash solution， 高速离心 10000 rpm 30 sec。 重复步骤“一次。 取下 UNIQ-10 柱，倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放回收集管中，高速离心 10000 rpm 1 min。 将UNIQ-10柱放入一新鲜洁净的1.5 ml离心管中，在柱膜中央加30 Elution Buffer或双蒸水pH>7.0到U

26、NIQ-10柱中，室温或37C放置2 min。提高洗脱温度至 55-80C有利于提高 DNA的洗脱效率 10000 rpm高速离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于 -20 C备用。 取35 UPCR纯化产物加适量加样缓冲液混合，琼脂糖电泳检查回收率，可根据带的亮度估算 DNA回收纯化后的浓度。(2) PCR产物直接纯化法按生工生物工程 (上海)UNIQ-5柱式PCR产物纯化试剂盒说明进行： 取PCR产物4050 d，参加3倍体积的Binding buffer，混匀。 把混合液转移到套放于 2 ml收集管的UNIQ-10柱中，室温放置 2 min，用台式离心机高

27、速8000 rpm 离心 1 min 。适当降低离心转速有助于提高 DNA 结合率。 倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，参加500 dWash solution，高速离心10000 rpm 30 sec。 重复“步骤一次。 倒掉收集管中的废液，将 UNIQ-10 柱放回收集管中，高速离心 10000 rpm 1 min。 将UNIQ-10柱放入一根新鲜洁净的 1.5 ml离心管中，在柱膜中央参加 30 dElution Buffer或双蒸 水pH>7.0到UNIQ-10柱中，室温或 37C放置2 min提高洗脱温度至 55-80C有利于提高 DNA的洗 脱效率。 1

28、0000 rpm高速离心1 min，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用或保存于 -20 C备用。 取510 d PCR纯化产物加适量加样缓冲液混合，电泳检查回收率，可根据带的亮度估算DNA回收纯化后的浓度。六动物寄生虫病特异PCR诊断技术实例以检测鸡柔嫩艾美尔球虫感染为例，选用 Fernandez 等 2003报道的柔嫩艾美尔球虫种特异的引物(Tn-01-F : 5'-CCGCCCAAACCAGGTGTCACG-3'Tn-01-R : 5'-CCGCCCAAACA TGCAAGA TGGC-3 '),建立特异、敏感、快速的特异PCR诊断技术，用于鸡柔

29、嫩艾美尔球虫感染的诊断及分子流行病学调查。1 . PCR反响。 按常规方法进行，在 0.2ml PCR管配制反响液，总体积为25 dL其中：试剂体积 dl10x PCR BufferMgCl 2 25 mM dNTPs2.5 mM each2Forward primer Tn-01-F, 50 pmol/ l d Reverse primerTn-01-R, 50 pmol/ ld ddH2O rTaq 5 U/ dl模板 gDNA1同时设阳性对照和空白对照。2 .反响在PCR仪上进行。反响条件为：96C预变性5 min，然后94C变性1min、65C退火2min ,共30个循环，最后72 C后延伸7 min。3. 结果判定。 PCR 产物在 1.0%TBE 琼脂糖凝胶电泳， 用溴化乙锭染色， 紫外投射仪下观察结果。 阳 性对照可见分子量大小约 530bp 的条带；临床样品如有同样大小条带判为阳性；阴性对照不见扩增条带。四、实验考前须知一寄生虫基因组 DNA的提取及纯化1操作中所使用的镊子和剪刀一定要事先灭菌并于超净工作台中紫外照射11.5 h,以保证没有污染其它 DNA 。2吸取上清液时,应注意勿将下层沉淀物吸入以免带入杂质,但也不要余下太多上清液,致使DNA损失较多。3整个操作过程中, 一