小鼠胚胎干细胞培养

1、以下培养针对于小鼠的 R1 胚胎干细胞 系，其它 胚胎干细胞 的培养可以参考。 不过人的胚胎 干细胞培养 不可以采用下面的 protocol ，需要用专用的 protocol 和培养基。一般培养维持 ES 细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF 白血病抑制因子和Feed细胞的培养基高糖来阻止细胞的分 化。为细胞提供包被有明胶的平板作为粘附细胞的基质。 建议每 23 天从到达 80 90 融合的平板按 1：8 的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在明胶包被的培 养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2 个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置

2、于37C, 5% C02 ,100%湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用 MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其 分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及 Feed细胞。Feed细胞可以来源于 STO细胞或原代胚 胎成纤维细胞。培养基ES:配制一 20X不含DMEM , HS , LIF的溶液该溶液也能用于 EB培养基见下文。分装 在50ml离心管中，稀释为 2X,每管42ml，贮存在-20 C。通过将21ml该溶液，HS和 LIF参加450ml DMEM 中制备培养基，0.22卩滤膜过滤。贮存于4C,时间不要超过2周。贮存液DMEM (高糖) 马血清( HS)L-谷氨

3、酰胺(200mM )MEM NEAA (10mM) HEPES(1M)3巯基乙醇(55Mm )PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10%二甲基亚砜DMSO 中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然 而,二甲基亚砜对细胞有毒性,快速的进行细胞复苏是很重要的。步骤：1从液氮中取出一管细胞；2将冻存管置于37C水浴中2分钟或放到管内溶液恰好完全溶解； 3将细胞转移到一 15ml Falcon 管中；4参加 5ml ES 培 养基 用培养基冲洗冻存管；5离心 3分钟；6弃上清,用 2ml ES 培养基重悬细胞,至少吹打 10次； 7接种在明胶包被见下文的 6 孔或 6cm 组织培养皿； 8孵育。冻存细

4、胞 冻存液90HS 和 10DMSO步骤：1. 1 XPBS洗细胞并留少许 PBS在培养皿内；2用细胞刮刀收集细胞；3. 将细胞转入 15ml 离心管管内并离心 3 分钟；4. 弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中10 cm 的培养皿用 2ml，15cm 的培养皿用 6 7ml。5. 分装于冻存管内，每管 1ml ；6. 置80 C过夜，第二天移入液氮。Geltin 明胶包被 准备 geltin 溶液1. 将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中50 65C水浴1530分钟。2. 最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22卩滤膜过滤，贮存在 4C。 包被培养板或培养皿1. 参加足量的明胶溶液

5、覆盖培养平面15 cm培养皿加2ml, 10 cm培养皿加1 ml，溶液 的量并不重要，只要能完全覆盖培养外表就行了。；2. 置室温 30 分钟；3. 去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶 污染盖子和流出培养板。细胞传代建议每 2 天传代细胞一次， 过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率， 我们建立了一种纯化 方法来去除分化细胞， 在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前， 通过将分化细胞黏附在没 有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。1 .去除培养液；2. 无钙镁 PBS Gibco 洗涤；3. 参加胰酶 EDTA Gibco 。37

6、 C孵育5分钟。4. 参加 ES 培养基使胰酶失活；5. 将细胞转入 15 ml 离心管中离心 3min；6. 去除上清，将细胞重悬于2 ml ES 培养基，至少吹打 1020次。如果参加培养基的量较少会比拟容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。7. 将细胞接种在没有包被的组织培养皿中使用和一开始同样规格的培养皿放入温箱2 小时分化细胞在该时间内将黏附，而 ES 细胞仍将保持悬浮；8. 将含有细胞的培养基转入geltin 包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开前面已 经提到 ES 细胞有聚集成团的倾向9. 建议按 1

7、：41：10的比率传代ATCC保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8 的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1 来计算传代比率。体外分化 胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。 我们的体外分化方法有利于神经前体细胞 通过在最少量的培养基内选择第 3 步，在有 bFGF 存在的情况下扩增第 4 步并最终 分化在第5步。细胞全程培养在 37C, 5% C02 ,100%湿度条件下。一般体外诱导向神经 细胞方向分化，也可以采用低浓度的 RA 进行诱导。时间线总时间为 2734天第2步；41天第 3步；410天第 4步；4天 第5步；1

8、015天 体外向心肌细胞方向分化胚胎干细胞在体外去除 LIF 情况下会自然向心肌细胞方向分化,小鼠的 R1 系一般在第 7-8 天自然出现搏动的心肌细胞,与胚胎发育时间线是完全一致的。培养基EB配制一 20X不含DMEM , FBS, LIF的溶液该溶液也能用于 ES培养基见前述。分 装在50ml离心管中，稀释为2X,每管42ml,贮存在-20 C。将21ml该溶液和50ml FBS 参加450mlDMEM中制备培养基，滤膜过滤。贮存于 4 C。贮存液DMEM 高糖胎牛血清L-谷氨酰胺200mM MEM NEAA 10mMHEPES1M3巯基乙醇55Mm PEST P104U/mlS104 卩

9、 g/mlITSFn a nd N3 分化培养基：配制一 20X不含DMEM/F12的溶液。分装在15ml离心管中，稀释为 1 X,，滤膜过 滤，贮存在-20C。将该溶液参加 DMEM/F12中制备培养基，贮存于4C。贮存液DMEM 高糖转铁蛋白 50mg/ml胰岛素 5mg/ml亚硒酸钠300讪黄体酮20讪腐胺100讪PEST P104U/ml S104 卩 g伽I层粘连蛋白100卩g/ml纤维连接蛋白250卩g/ml碱性 rhFGF, 10 卩 g/ml*在第 4 步将 bFGF 参加 N3 培养基使终浓度为 10ng/ml。ITSFn a nd N3 培养基贮存液的准备 使用无菌的溶剂和

10、稀释液, 在分装之前要对溶液进行过滤, 如果因为某些原因溶液在分装之 前没有进行过滤,需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养 。贮存液 溶剂,贮存液,稀释剂和储存转铁蛋白 50mg/ml胰岛素 5mg/ml亚硒酸钠300讪黄体酮20 口M腐胺100MPEST P104U/ml S104 卩 g伽I层粘连蛋白100卩g/m纤维连接蛋白250卩g/ml 碱性 rhFGF, 10 卩 g/m包被有多聚鸟氨酸 /纤维结合蛋白的培养板使用或不使用盖玻片包被液的准备多聚-L-赖氨酸，15卩g/ml把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1沖BS混合。贮存在 4C。纤维结合蛋白，1卩

11、g/ml把纤维结合蛋白和 500ml 1 >PBS混合。包被过程：1. 参加多聚-L-赖氨酸，至少2 3小时过夜也行2. 吸出多聚-L-赖氨酸3. 参加纤维结合蛋白，大约12小时4. 吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干5. 贮存在4C24孔板用200卩,1 6孔板用500卩。1震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。有时需 要剧烈震荡培养板。体外分化方法第 1 步： ES 培养基在 LIF 存在的条件下维持细胞培养第 2 步： EB 培养基使用细菌培养皿去除 LIF 后胚状体的形成需要 4天。1 .分散纯化细胞参见上面的细胞传代局部2. 纯化 2 小时后将细胞转入含有 ES 培养基的

12、50ml Falcon 管中，计数细胞取适量体积放入 15ml 管中离心 3 分钟。3. 用 2mlEB 培养基重悬细胞，吹打至少1 0次制成单细胞悬液4. 一个15cm的细菌培养皿接种 45>06个细胞1个完全融合的组织培养皿通常足以接 种 4 个同样规格的细菌培养皿。5. 2 天后更换培养基将胚状体转入锥形管中放置 35分钟使细胞沉降。弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并 接种在新的细菌培养皿中。6. 用 EB 培养基培养的第 4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中这即是细胞的移植步 骤。 1个组织培养皿之中放置 1个细菌培养皿，在进行第 3 步之前一天将胚状体黏附在同 样规格的培养板上

13、。形成胚状体需要 4 天时间。在 EB 培养基中再培养 1 天使胚状体粘附在组织培养皿的外表。 这一天被认为是第 2 步和第 3 步的分界。第 3 步 ITSFn 培养基 在最少量培养基中选择神经前体细胞 1在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn 培养基2并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部 分胚状体留在培养皿内。3保持细胞在 ITSFn 中培养大约 10 天，根据需要更换培养基大约每隔一天。 观察细胞形态， 神经样细胞大约出现在第 4 到第 7 天。当神经样细胞能够被鉴别时， 转入到 第 4 步。步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰

14、的标志几天以后，通常是在第 3 步的第 6 到第 10 天。第 4 步 N3 培养基 bFGF通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF 的培养基中进行扩增。洗涤，参加 1-2ml 胰酶2. 37C孵育5分钟3. 用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置35分钟移出细胞团，将上 清移入一新的离心管离心。4. 将细胞重悬于含有 bFGF 的 N3 培 养基。5 .将细胞接种在包被多聚 -L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上最好将盖玻片放于24孔培养板或 6孔培养板， 6孔培养板中每孔放置 5个盖玻片如果是塑料的放置 4个，以使最大可 能的获得样品数量。 24孔板接种3.5

15、>105/孔或6孔板1.7 >106/孔。6. 2 天后更换培养基第 5 步 N3 培养基通过撤除 bFGF 使神经前体细胞分化1 .细胞被接种在盖玻片上 4 天后将培养基换成不含 bFGF 的 N3 培养基2. 根据需要换液大约每隔一天3. 分化 10 15 天后固定细胞移除培养基PBS 洗涤参加 4%福尔马林室温放置 30 分钟PBS 洗涤 2 次储存于PBS。长期储存使用含叠氮化纳的PBS移植细胞的准备细胞在胚状体形成 4天以后被移植相应于体外分化过程中的第 2步末细胞被转种到组织培 养板 。正如在前文体外分化中所描述的在移植之前 4天开始形成胚状体。 通常再需要一天 时间以

16、便将胚状体移植入一 10cm 的培养皿。移植1将胚状体转移至一 15ml圆锥形管中放置 35分钟使胚状体沉降下来。细胞被离心 3 分钟会更好。 放置使之沉降将会去除更多的单个细胞 包括死细胞 而这些细 胞可以被离心下来。2.去除上清将胚状体重悬于无钙镁离子的1沖BS中3离心 3分钟4. 去除上清参加1胰酶10cm的培养皿加1ml5. 37C水浴5分钟6. 参加 5mlEB 培养基小心吹打约 10次 小心处理细胞很重要，进行细胞传代分散细胞时不可剧烈吹打。7. 离心 2分钟&吸出上清将细胞重悬于 500卩I EB培养基9. 用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次10. 离心 2 次11 .吸出上清将细胞重悬于100卩I EB培养基烟酸己可碱标记ES细胞进行移植1. 准备