浅论门静脉高压症大动物模型的研制进展

1、浅论门静脉高压症大动物模型的研制进展         【关键词】  门静脉高压症 大动物 模型用于制造门脉高压症动物模型最常用的动物为鼠与兔，但如欲对门静脉高压症的手术方式进行研究，则小动物模型难以达到预期的效果且操作不方便，因此选择一种理想的大动物门静脉高压症模型，对于评价外科治疗效果非常重要。多年来，国内外学者探讨了多种制备门静脉高压症大动物模型的方法，每种方法都有其优点，但也有其局限性，现综述如下。1  肝前型门脉高压症模型的制作1.1  缩窄门静脉主干制作模型 将门静

2、脉主干部分缩窄可减少门静脉口径，使血液回流受阻从而导致门脉压力升高。1980年Van Thiel1首次报道此方法：把一个20号钝头直针纵向置于门静脉主干旁，用丝线将门静脉和直针结扎后抽出直针，可造成门静脉一定程度的狭窄，从而建立门脉高压症动物模型。理论上讲，完全阻断门静脉可使门静脉压力升高最多，但一次完全结扎门静脉可导致严重的胃肠淤血及肝脏缺血，除恒河猴外几乎毫无例外地会导致实验动物死亡。国内学者李宗芳采用门静脉主干缩窄1/2加丝线慢性栓塞的方法，成功通过一次手术而逐渐完全阻断门静脉，成功制成犬的肝前型门静脉高压症模型。术后动物存活率为95.5%，术后2周门静脉造影见主干已闭塞，术后34周门静

3、脉压力升为(2.83±0.66)kPa，胃镜检查食管胃底静脉曲张形成率为80.9%。此后赵莉等对实验犬部分结扎门脉使其截面积缩小95%后，分别在术后不同时间再次开腹观察，发现28周门脉压较高，但随着侧支循环的建立，压力逐渐下降，1216周门脉压才趋于稳定。门静脉主干部分结扎形成门脉高压症动物模型具有制作简单、可复制性强、门脉压力升高迅速，侧支循环形成明显等特点。但该类模型肝脏组织学几乎正常，门脉压力随侧支循环的开放而逐渐下降，主要适于门静脉系统高动力循环状态的研究，以及门静脉高压症前向性学说的探讨。1.2  门-腔静脉吻合制作模型 Saku等提出用血流量较大的下腔

4、静脉与门静脉吻合制作犬门静脉高压症模型，由于压力形成不稳定，效果不理想。Dennis等在此基础上又同时缩窄门静脉主干，使模型制作效果有很大提高。其方法是，开腹行下腔静脉和门静脉主干的侧侧吻合，吻合口长度约2.53.0 cm，于吻合口上方的门静脉内置入1个内含琼脂环的钢圈起固定作用。琼脂吸水后不断膨胀而逐渐阻塞门静脉，在吻合口上方双重结扎腔静脉，使其下方的血液完全注入门静脉系统。用此法36周后全部成模，无死亡，门静脉压力明显增高，食管胃底静脉丛呈不同程度曲张，肝脏组织学改变不明显。秦云峰等对上述方法做了改进，在下腔静脉-门静脉侧侧吻合、下腔静脉结扎及门静脉部分缩窄的基础上，采用介入放射学经导管栓

5、塞技术处理门静脉，经导管用自制不锈钢丝卷阻塞门脉肝端。该方法造模的犬全部成活，吻合口通畅，术后门脉压力高，胃镜和X线门脉造影以及病理切片证实食管下段黏膜下曲张静脉形成。黄莚庭等也在犬上施行大口径门腔侧侧吻合术，然后在吻合口的近心侧结扎下腔静脉，做成腔门转流术后门静脉高血流状态的动物模型，结果发现门静脉尽管可以稳定地保持高血流状态，门静脉压力也持续不同程度地升高，但无明显侧支形成，肝脏也无组织学变化，肝功能良好，可见单纯的门静脉高血流状态并不能很好地形成门静脉高压症。而徐辉等采用改良Stiegmann方法，对实验犬门静脉结扎，使门静脉管径缩小40%60%，同时在肾上水平横断下腔静脉，近段关闭，远

6、端与门静脉行端侧吻合，建立稳定的门静脉高压食管静脉曲张动物模型。门-腔静脉吻合制作的门脉高压症动物模型，门静脉压力高，且相对稳定，形成明显的侧支静脉曲张，是具有食管胃底静脉曲张的门静脉高压症大动物模型，成功率高，重复性好，死亡率低，为食管胃底静脉曲张及内窥镜注射硬化剂治疗出血的研究提供了便利条件。2  肝内型门静脉高压症动物模型2.1  四氯化碳诱导肝硬化门静脉高压模型 1936年Cameron和Karunaratne首次报道应用四氯化碳制作肝硬化动物模型。大动物最常见的给药途径是口服和腹腔注射。1993年国内学者吕明德等10采用复合致病因子法成功制备了狗肝硬化模

7、型，通过腹腔注射CC14，外加高脂低蛋白饮食与饮用乙醇水增加了肝细胞对CC14敏感性，促进肝脏病变。于实验第8周末肝硬化形成率达91%。 此后国内学者刘小玲11通过经胃管胃肠灌注CC14法建立稳定的犬肝硬化门脉高压模型，死亡率为27%。曹罡等12采用门脉置管四氯化碳注射法制备狗肝硬化模型，即选取犬脾静脉属支插入硅胶管至近脾静脉主干处固定后，定期经导管缓慢滴注四氯化碳脂肪乳的葡萄糖稀释液。此给药方式不仅可根据动物体重及一般情况变化灵活调节药量、浓度及给药速度，而且对腹腔干扰轻微，非常有利于进一步进行外科学研究。而周忠信等13采用CC14与加苯巴比妥钠配合高脂低蛋白低胆碱饮食制备小型猪肝硬化门脉高

8、压症模型，实验成员以广西巴马小型猪为实验对象，每日饲以经调配的高脂低蛋白低胆碱饮食，由65%米饭加35%猪油和胆固醇混合组成，无水乙醇稀释成10%作为唯一饮料。12头小型猪于实验16周末均成功诱导出肝硬化，按Madden分级法14，17头达到I级，5头达到IV级，成功率为100%，死亡率为零。CCl4所诱导的肝硬化模型有一定程度的门体分流，与人类营养障碍型肝硬化较为相似，经常被用来研究肝硬变后门脉高压症的血流动力学变化，但是该模型的纤维化和肝结节形成程度相对较轻，并且全身毒性作用大，可导致多器官功能衰竭，因此存在死亡率高的缺点，影响了其应用范围。2.2  二甲基亚硝胺（DMNA）诱导

9、肝硬化门脉高压症动物模型 DMNA主要在肝内微粒体药物氧化酶系统进行氧化代谢后，产生活性甲基、酯酰烷基亚硝、甲烷亚硝胺胺等中间代谢产物，具有肝细胞毒性，导致肝细胞坏死，造成实验动物弥漫性、特异性损害。1937年，英国学者Freund首先报道了2例有明显DMNA接触史的肝硬化病例，因而国内学者金树根15以此采用DMNA蒸汽吸入对犬进行染毒，成功复制类似上述病例的肝脏再生结节性肝硬化，首次用DMNA成功地制备出大动物肝硬化模型，其后通过口服16、静脉内给药17成功复制出门脉高压动物模型。一般形成门脉高压状态需5周左右，但出现明显的肝硬化及腹水需要3、4个月18-19。该种方法不足之处是：

10、DMNA本身是一种致癌物质，毒性大、易挥发，影响周围环境和人群，近年来，选用此种方法制备动物肝硬化模型很少见。2.3  胆总管结扎法致肝硬化门脉高压症动物模型 通过结扎缩窄胆总管，使胆汁排出受阻，肝内胆汁淤积，制作肝硬化的模型。 Gliedman等20发现肝内血管系统结构的扭曲和变形是该模型形成门脉高压症的重要原因。Shasha等21以犬作为实验对象，结扎胆管，4周后成功地制备了狗胆汁性肝硬化、门脉高压模型，用于研究胆汁性肝硬化血液动力学变化。此后Bosch等22对犬进行胆总管结扎，并对全身及门静脉区的血流动力学进行研究发现，经过8周后模型的门静脉压力达到(1.77

11、7;0.08)kPa，制成了门脉高压模型，证实胆汁性肝硬化血液动力学变化与人类相似的观点，并用于评价肝硬化、门脉高压药物治疗效果。此外，这种大动物门脉高压模型也适合观察胆汁性肝硬化的外科手术治疗效果，国内史留斌等23、裘法祖24先后采用此方法复制出大动物肝硬化模型，并用于药物及手术治疗效果的评价。此建模方法较成熟，在猴等其他大动物身上也取得成功25。胆总管结扎法制作的门脉高压症模型，门静脉压力升高显着，并可出现广泛的门体分流。该模型与人类肝硬化患者在门脉及全身血流动力学方面有较好的相似性，适合对门脉高压症病理生理进行研究，是验证药物对门脉高压症作用的有效模型，还适合用于胆汁性肝硬化研究。但是存

12、在以下缺陷：死亡率高达50%，腹腔黏连，不利于下一步外科手术操作，胆管解剖变异导致建模失败。2.4  门脉末梢栓塞制备门静脉高压症模型 1957年Tay-lor首先介绍门静脉注入二氧化硅混悬液建立犬肝硬化门脉高压症模型的方法。此后Buergener26用聚乙烯醇(polyvinylalcohol，PVA)以狗为对象制作门静脉高压症模型。PVA是一种永久性血管阻塞因子，与血吸虫卵相似，阻塞于门静脉分支末梢，引起汇管区炎症，逐渐产生肝硬化。其方法是经皮肤穿刺，将套管置入门静脉主干，注入PVA，每次0.10.9 g，每隔12周1次，每次由0.1 g开始，逐渐加量至门静脉压达到或超

13、过20 cmH2O，并稳定于此。3个月后成模，随着肝内门静脉较大分支被阻塞，狗存活率下降。成模后门静脉压力显着增高，34周后，出现门体侧支循环，8个月后肝脏呈不同程度增生。此后，大西久仁彦等27用大肠杆菌成功地制作出狗门静脉高压症模型。其方法是将非致病性大肠杆菌用1%福尔马林杀灭，再将其煮沸，使其只具有O抗原，并制成O抗体血清，将该血清和被杀死的大肠杆菌按比例混合后置于50 培养箱内孵育，再把此种混合液以4 mL/kg，由肠系膜上静脉插管注入到门静脉， 2周内注入710次，1个月后再注入1次，2.5个月后即可成模。成模后门静脉压力显着增高，血流量增大，阻力增高；脾脏重量增加，血流量增大，阻力下

14、降；空肠、回肠、结肠及网膜血流量增大，同时阻力下降；病理检查示门静脉末梢纤维化、萎缩及狭窄，门静脉区血管紊乱，该模型适用于特发性门静脉高压症的研究。国内学者王瑞祥等28在犬上用埋入式药泵置入门静脉主干后，按100 mg/kg的剂量经药泵分批次注入100400m PVA颗粒，3个月后形成不同程度肝纤维化门静脉高压症，并有不同程度的脾大及腹水。考虑到PVA主要依赖进口，陈军等29采用300500m的葡聚糖微球以10 mg/kg的剂量，每5天注射葡聚糖微球1次，经门静脉留置导管注入猪门静脉，22 d制成猪窦前型门静脉高压症模型，而葡聚糖微球是一种长效栓塞剂，球与血液等比重，栓子不易结块，使用方便，疗

15、效持久。门静脉末梢栓塞法制备门静脉高压症模型，方法简单，动物存活率及成功率较高，并可经药泵反复进行门静脉造影，了解侧支循环开放情况。所制备的动物模型，其肝内门静脉血流梗阻更符合临床，门静脉压力升高迅速，适合窦前型肝硬化与肝硬化血流动力学改变及门体分流的研究。         3  肝后型门静脉高压症动物模型肝后型门脉高压症临床上最常见的疾病为Budd-Chiari syndrome，即肝流出道阻塞引起的病理生理学改变。通过置入缩窄环于肝上段下腔静脉或肝静脉与下腔静脉汇合处，逐渐形成肝静脉流出道阻塞。结扎肝

16、静脉或肝静脉汇入腔静脉处下游的下腔静脉，可造成肝充血及腹水为特征的肝后型门静脉高压模型，单纯使用本方法，并不能或仅能产生暂时性门静脉高压。国内学者白殿卿等30在犬上用进腹途径采用左肝静脉缩窄的方法建立肝后性门脉高压动物模型，此模型在术后平均7 d即出现腹水，适用于门脉高压症腹水方面的研究。此后，王春喜等31通过介入技术找出犬肝右静脉和肝左静脉，保留一支主干肝静脉，通过注入无水乙醇破坏肝静脉的内膜，送入钢丝圈和明胶海绵进一步阻塞肝静脉和局部血栓形成，逐渐形成肝静脉闭塞或严重狭窄，造成肝脏血液回流障碍，瘀血性肝脏肿大，逐渐形成肝硬化门静脉高压，并出现胃底食管静脉迂曲扩张现象，病理切片下形态学结构与

17、人类肝静脉阻塞引起的肝硬变即布加氏综合征形成的肝硬变一致。但介入方法的实施需要专门的技术与特殊的设备，限制了模型的广泛使用，而且这种模型血流动力学干扰大，不适于这方面研究。综上所述，制备门脉高压症大动物模型的方法虽多，但是与人们预期目标存在较大差距。理想的大动物门脉高压症模型应具备以下条件：与人类肝硬化门脉高压的特征相同，造模成功率高，死亡率低，周期短，方法简单易行；造模因素对人体无害或者较少危害，环境污染小；腹腔干扰少，利于外科手术操作等。然而目前尚无一种理想的大动物门脉高压症模型能够满足上述要求，因而，寻找理想的门脉高压症大动物模型需要进一步探索和研究。【参考文献】  1 Van

18、 Thiel DH, Gavaler JS, Slone FL, et al.Is feminization in alcoholic men due in part to portal hypertension: a rat modelJ.Gastroenterology,1980,78(1):81-91. 李宗芳,刘效恭,王英,等. 缩窄门静脉主干12加丝线慢性栓塞术制备犬门静脉高压症模型 J.中华实验外科杂志,1997,14(5):314-316. 赵莉,李振东,于增文,等.肝前型门静脉高压症动物(犬)模型制作体会 J.中华小儿外科杂志,2001,22(1):42-44. Saku M,

19、Borgesson B,Olin T,et al.An attempt to induce por-tal hypertension and esophageal varices in the rat J.EurSurg Res,1976,8(2):166-171. Dennis ML,Gustavo AM,Jorge IT,et al.A reproducible ca-nine model of esophageal varices J.Gastroenterology,1983,894(2):573-579. 秦云峰.狗门脉高压症食管曲张静脉模型的制备 J.中华实验外科杂志,1987,4

20、(1):19. 黄莚庭,王维民,韩铁然,等.门静脉高血流状态的动物实验研究 J.中华外科杂志,1993,31(4):195-199. 徐辉,陈虹彬,蒋明德,等.合金支架治疗食管静脉曲张出血的实验研究 J.西南国防医药,2003,13(4):358-360. Cameron CR, Karunaratne WAE. Car-bon tetrachloride cir-rhosis in relation toliver regeneration J.J Path Bact,1936,42(1):1-21.10吕明德,黄洁夫.腹腔注射四氯化碳配合营养控制制备犬肝硬模型 J.中华实验外科杂志,199

21、3,10(2):56-57.11刘小玲.经胃管胃肠灌注法建立稳定的犬肝硬化门脉高压模型的观察 J.局解手术学杂志,1994,3(4-12):29-30.12曹罡,黎一鸣.门脉置管四氯化碳注射法制备狗肝硬化模型J.中华肝胆外科志,2001,7(4):244-245.13周忠信,王捷,罗葆明.小型猪肝硬化模型建立过程中肝脏功能及组织病理学的改变 J.上海实验动物科学,2002,22(2):102-104.14Zerm MA,Saber MA,Shafritz DA.Molecular mechanisms for changes in heptic protein synthesis induce

22、 by schistosomia-sis infection in mice J.Biochemistry,1983,22(26):6072-6077.15金树根.二甲基亚硝胺致实验性肝损伤的研究概况 J.中西医结合肝病杂志,1993,3(1):49-51.16Madden JW,Gertman PM,Peacock EE.Dimethylnitrosamine induced hepatic cirrhosis:a new canine model of an ancienthuman disease J.Surgery,1970,68(1):260-267.17Mwanza,Miyamoto,Okumura M,et a1.Ultrasonography,bio-chemical a