浅论消除大鼠深部脑刺激伪迹的实验研究

1、浅论消除大鼠深部脑刺激伪迹的实验研究                  作者：高东明刘春娜，亢宁，林宇涵，张晓黎【摘要】  目的 消除刺激伪迹，以揭示DBS的作用机制。方法 Spike 2系统特有的生物信号处理功能，综合使用数字滤波、双窗口电位与信号波形鉴别方法消除刺激伪迹。结果 经刺激伪迹消除处理可以清楚显示脑内高频刺激期内神经元的放电活动的变化。结论 我们的方法可有效地清除刺激伪迹。 【关键词】  深部脑刺激;刺

2、激伪迹;大鼠   Abstract: Objective The research aims to remove the stimulus artifact, and to explore the mechanism of deep brain stimulation.Methods Through using the functions of digital filter, spike waveform detection and potential filter in two windows performed by the Spike 2 system, t

3、he stimulus artifact was eliminated.Results The change of neural discharge activities during deep brain stimulation could be revealed clearly.Conclusions The method can be effectively used in the stimulus artifact removal.Key words:deep brain stimulation; stimulus artifact; rat自从1987年法国着名的神经外科学专家Ben

4、abid教授成功地应用丘脑腹内侧核(VIM)高频刺激治疗帕金森病(PD)以来，靶点为VIM，内侧苍白球(PGI)或丘脑底核(STN)的深部脑刺激(deep brain stimulation，DBS) 已经成为国际功能神经外科治疗PD首选方法1，2 。人们也尝试用DBS治疗中枢性疼痛、癫痫4，5等疾病，甚至用于戒毒和肥胖症的治疗。但由于强大的刺激伪迹掩盖了刺激对神经元放电活动的影响，人们是通过刺激的后作用和对远隔神经递质释放的影响来间接分析DBS的机制。有人认为DBS的直接作用是抑制，但也有学者认为是兴奋作用。至今DBS的机制仍在争议中尚无定论。这也限制了这一方法应用的拓展。本文基于Spike

5、 2系统特有的生物信号处理功能，综合使用双窗口电位鉴别、数字滤波和信号波形鉴别方法消除刺激伪迹，以揭示DBS的作用机制。1 材料和方法1.1 实验动物成年雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250300 g(辽宁医学院动物中心提供)。大鼠在标准环境下饲养，室温2025 ，24 h昼夜循环光照，自由摄食饮水。1.2 电刺激及记录大鼠经20%氨基甲酸乙酯(0.8 mL/100g)腹腔麻醉后，置于脑立体定位仪上。行常规开颅手术，剥除硬脑膜，并行小脑延髓池引流，降低颅内压，防止脑疝。细胞外记录采用微电极拉制仪(美国STOELTING公司)自行拉制的单管玻璃微电极。电极尖端直径2 m，电阻515

6、M，管内灌注含1%滂胺天蓝的3.0 mol/LNaCl溶液，借助微电极推进器将记录电极缓慢推进到大鼠的相应核团内(核团坐标参照Paxions & Watsons大鼠脑图谱确定)。单位放电经微电极放大器采集、滤波(3003 000 Hz)、显示于示波器，并输入计算机用Spike 2 生物信号采集系统(英国CED公司)处理。实验中只对信噪比3/1和放电稳定的神经元进行记录。在进行电刺激前每一单位需记录23 min的基础放电。核团电刺激采用A320R隔离刺激器(美国WPI公司)经同心圆电极输出。电刺激参数为：频率(20200 )Hz，刺激强度0.4 mA，波宽0.06 ms，刺激时程5 s。

7、1.3 组织学检测在每一次电生理学记录完毕后，经微电极电泳滂胺天蓝(-20 A，15 min)标记记录部位，刺激部位采用直流电损毁法标记。大鼠用含4%多聚甲醛的0.1 M磷酸缓冲液经颈动脉灌流固定后，立刻断头取脑，放入相同固定液中浸泡4 h，再将脑组织移入30%的蔗糖磷酸缓冲液(pH7.4)至沉底后行冠状冰冻切片，片厚30 m。焦油紫染色。光镜下观察，仅取记录和刺激部位均正确的资料进行统计学分析。         1.4 数据分析为了分析刺激期内神经元对刺激的反应，在在线分析的基础上，我们应用Spike2系统对神经

8、元的放电活动进行离线信号处理以消除刺激伪迹，然后做刺激直方图处理。首先用数字滤波(10010 000 Hz)进一步消除干扰信号，然后采用双窗口电位鉴别功能对神经元放电波形进行电位和波形鉴别，最后根据筛选出的神经元锋电位作刺激直方图处理(图1)。2 结 果实验观察了不同频率电刺激(20、50、100、130、200 Hz)STN对大鼠丘脑束旁核(PF)神经元自发放电活动的影响。结果显示刺激频率低于100 Hz时，多数神经元无明显反应;刺激频率大于100 Hz时，大多数神经元呈兴奋反应，放电频率明显加快。图2为一个PF神经元对不同频率STN刺激反应的序列密度直方图。图2A未做刺激伪迹消除处理，刺激

9、期内神经元的放电活动无法观察;图2B做了刺激伪迹消除处理;从图中可以清楚地观察到，刺激频率为20 Hz时，神经元对刺激无反应;当刺激频率大于50 Hz时，刺激期间神经元的放电活动就明显增加;刺激停止后，这种兴奋作用还要持续一定时间，但兴奋作用较刺激期内明显减弱。3 讨 论虽然DBS治疗PD取得了可喜的成绩，但这一技术在功能神经外科领域的拓展应用仍受限，其原因主要是DBS的机制尚未确立，存在很大的争议。以Benabid为代表的学者认为高频刺激对所刺激的神经元是抑制作用，可能是由于去极化阻滞或神经递质的耗竭所致;另外一些学者认为是兴奋了抑制性神经通路所致8，9。这些分歧的根源在于脑内刺激的部位与记

10、录神经元放电活动的部位相距很近，较强的刺激伪迹几乎完全掩盖了弱小的神经元放电，不能观察刺激期内神经元放电活动的变化。大多数对刺激作用的观察都为刺激的后作用。有人试图采用不同的刺激隔离器以阻断刺激伪迹但效果不佳。随着实验室环境、记录仪器和导线的设置，以及实验动物状态的变化，刺激伪迹的强度和波形都要发生变化，致使常规的消除刺激伪迹的方法难以把神经元的锋电位从伪迹中分离出来。本实验利用Spike2生物信号处理系统对记录的结果进行离线处理。首先对记录到的信号进行数字滤波，其主要目的是滤除交流电等干扰，然后采用双窗口电位鉴别，即通过分别设置正向波和负向波上限和下限电位的方法鉴别锋电位波形，将神经元的锋电

11、位成功地从刺激伪迹中分离出来，再根据锋电位的波形做刺激直方图处理。这样就可以直接观察到刺激过程中神经元的放电活动。我们的方法有益于揭示DBS的机制，以拓展这一技术的应用。【参考文献】  1 BenabidAL. Deep brain stimulation for Parkinsons diseaseJ.Curr Opin Neurobiol，2003,13(6):696-706. Kern DS，Kumar R.Deep brain stimulation J. Neurologist，2007，13(5):237-252. Franzini A，Leone M，Messina G

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