永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性

1、永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性                 作者：李羽，白雪帆，王军，徐哲，张岩【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体Establishment and biological characterization of an immortalized human fetal hepatocyte line【Abstract】 AIM: To establish an immortaliz

2、ed human fetal hepatocyte line and to study its biological characteristics and functions. METHODS: Human fetal hepatocytes were transfected with pcDNA3.1 recombined vector containing the Simian Virus 40 large T antigen. Characteristics of the immortalized fetal hepatocyte line were evaluated by morp

3、hologic and functional detection. RESULTS: One of the hepatocyte clones displaying highly differentiated in liver function and immortalized characteristics had been screened after 40 day selection of 700-300 mg/L G418. The immortalized hepatocyte line maintained the most morphologic characteristics

4、of primary hepatocyte. The cell cloneforming rat was 31.2%. The immortalized human fetal hepatocytes had a normal karyotype and were not able to grow in soft agar culture. It had the ability of composing albumin and the immunohistochemical test showed that the SV40T gene had been integrated into the

5、 transformed cell genome. CONCLUSION: The immortalized human fetal hepatocyte line has the similar most morphologic characteristics and biological function to primary hepatocytes, and it would become ideal cell material on the study of bioartificial liver and hepatocyte transplantation.【Keywords】 im

6、mortalized; hepatocytes; cell line; characterizat ( 永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性 ) ion; SV40; liposomes【摘要】 目的: 构建永生化肝细胞系并对其生物学特性及某些功能进行研究. 方法： 利用SV40T基因和真核表达载体pcDNA3.1经脂质体转染至体外分离培养的人胚胎肝细胞，使其永生化，进一步鉴定其形态学特征和生物学功能. 结果： 经G418 700300 mg/L筛选，40 d后获得一株阳性克隆. 形态学观察发现，该细胞具有原代培养肝细胞的大多数典型特征. 永生化胚胎肝细胞克隆形成率为31.2%，染色体核型分

7、析表明细胞核型无明显异常，软琼脂集落形成试验表明细胞在软琼脂中不能生长，免疫组化证明SV40T基因已整合入细胞，而且该细胞具有合成白蛋白的功能. 结论： 新建胚胎肝细胞系具有与原代肝细胞类似的形态特征及生物学功能，可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料.【关键词】 永生化；肝细胞；细胞系；生物学特性；SV40；脂质体【中图号】 R512.60引言原位肝移植可以有效治疗各种原因引起的肝功能衰竭，因而成为治疗肝功能衰竭的唯一有效手段. 但由于受到技术复杂、价格昂贵尤其是供肝短缺的困扰，使它的临床应用受到很大限制，难以及时有效地挽救患者的生命. 研究显示生物人工肝及肝细胞移植可以作为一种

8、有效的替代治疗手段，帮助患者渡过危险期等待肝移植甚至直接取得令人满意的疗效，因而为肝衰竭的治疗提供了一种新的选择1-5. 而该项技术的应用需要足够数量肝细胞材料，动物肝细胞或者各种肝细胞系由于存在病毒感染及潜在的致瘤危险，无法成为理想的选择. 从理论上讲人源性肝细胞应该是最佳材料，但原代细胞体外培养增殖及传代困难，而且来源同样受到很大限制，为此我们采用脂质体转染的方法，构建了一株永生化胚胎肝细胞系，并对其生物学特性进行研究，希望可以为生物人工肝及肝细胞移植的临床开展提供理想而充足的细胞材料.1材料和方法1.1材料含有SV40 Large T抗原片段的质粒pcD2由北京大学人民医院妇科肿瘤中心刘

9、广芝教授惠赠，真核表达质粒pcDNA3.1由本校微生物教研室保存. 1428 wk水囊引产死胎由本院妇产科提供，DMEM培养基及胎牛血清购自Gibco公司；DMSO及秋水仙素为Sigma公司产品；抗SV40T单克隆抗体购自USBio公司；人血白蛋白单克隆抗体购自DAKO公司，质粒提取试剂盒为Promega产品.1.2方法2结果2.1重组质粒的鉴定重新构建的质粒SV40T/pcDNA3.1经BamH单酶切，酶切产物以10 g/L琼脂糖凝胶电泳，获得大小约2600 bp及5600 bp的2条带，前者符合Gen      Bank中SV40T片段大小（图1）.

10、图1重组质粒酶切鉴定（略）2.2胚胎肝细胞的培养及转染原代胚胎肝细胞经分离纯化，细胞存活率达91%. 体外培养48 h后，可见80%贴壁，经脂质体转染SV40T/pcDNA3.1重组质粒，G418筛选40 d后出现一簇抗G418的阳性克隆. 将其转移至新培养瓶内继续培养.2.3细胞形态观察胚胎肝细胞在培养瓶中呈单层贴壁生长，细胞呈椭圆形、典型的上皮细胞样特征，传代一次约需5 d时间（图2A）. 透射电镜观察，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管重建（图2B）.图2胚胎肝细胞形态结构（略）2.4细胞生长曲线根据MTT数据绘制的生长曲

11、线显示，细胞在培养第4日进入对数生长期，第7日进入平台期，第12日后开始出现凋亡（图3）.图3胚胎肝细胞生长曲线（略）2.5细胞克隆形成率及软琼脂集落形成试验细胞连续培养15 d，形成非常明显的克隆，克隆形成率为31.2%. 而在软琼脂培养基内，细胞连续生长20 d，未见有细胞克隆形成，说明该永生化肝细胞不能? （永生化胚胎肝细胞系的构建及其生物学特性(3) 谌砬碇嘌谏?2.6染色体核型分析第16，28，45代肝细胞各计数30个分裂相，均为正常二倍体细胞，染色体为23对，核型结构与正常人肝细胞相同（图4）.图4染色体核型分析（略）2.7免疫组织化学检测结果以抗SV40T单克隆抗体作一抗，免疫组

12、化检测可见肝细胞核内的棕色颗粒，证实SV40T基因已整合入胚胎肝细胞（图5A）. 另外该永生化胚胎肝细胞具备合成白蛋白的能力，免疫组化检测可见胞浆内有棕色颗粒着色（图5B）.图5免疫组织化学染色（略）3讨论近年来在重型肝炎的治疗方面已得到共识，即生物人工肝及肝细胞移植可以作为原位肝移植的有效替代治疗手段治疗肝功能衰竭，而且取得了一定的临床治疗效果. 然而由于供肝短缺和原代肝细胞体外培养增殖困难，使得肝细胞材料的相关研究成为关注的热点. 人们曾尝试采用异种肝细胞或各种肝细胞系如C3A，HepG2来解决这一问题6-9，常用的猪肝细胞应用最为广泛，效果也可靠，但异种肝细胞可引起强烈的免疫排斥反应，而

13、且由此带来的人畜共患疾病的感染无法避免10. 采用C3A, HepG2的生物人工肝在动物实验及部分临床试验中已取得肯定的结果，可是细胞系的来源为肿瘤细胞，研究显示它的细胞色素P450酶活性、氨清除和尿素合成功能均较差，加之用于处于免疫抑制状态的重型肝炎患者，潜在致瘤的风险始终令人担忧11-12.我们利用真核表达载体pcDNA3.1，将猿猴病毒40大T抗原基因通过脂质体转染至体外培养的原代胚胎肝细胞，经G418筛选40 d后获得一阳性细胞克隆. 生长曲线观察结果表明，该细胞具有永生化细胞系典型的“S”特征，细胞生长的每一阶段特征明显. 光学显微镜下观察，细胞呈典型的上皮细胞样贴壁生长，细胞增殖较

14、快；透射电镜观察发现，细胞呈典型的肝细胞形态与结构，细胞核仁增大，胞内含丰富的糖原颗粒，细胞极性恢复可见紧密连接和毛细胆管形成. 表明转染肝细胞在形态结构上与原代细胞无明显差异. 此外，我们构建的永生化胚胎肝细胞系的克隆形成能力较强，在软琼脂培养基中不能生长，而且核型组成与正常肝细胞相同，说明该细胞没有发生恶性转化. 经免疫组织化学检测，转染肝细胞核内染色可见大量棕色颗粒，表明SV40T抗原已整合入胚胎肝细胞内，另外人血白蛋白在细胞胞浆中有明确表达，说明该细胞系具备分泌蛋白的能力，具有正常肝细胞的某些功能.本研究结果表明，利用SV40T抗原，采用脂质体转染方法建立的这株永生化胚胎肝细胞系，具备

15、了原代肝细胞的典型形态特征以及某些生物学功能，为肝细胞体外长期培养以及功能维持提供了可能，应该可以成为生物人工肝及肝细胞移植研究中的理想细胞材料，从而为生物人工肝及肝细胞移植临床的广泛应用奠定更加坚实的基础.【参考文献】1 Di Campli C, Gasbarrini G, Gasbarrini A. A medicine based on cell transplantation is there a future for treating liver diseases?J. Aliment Pharmacol Ther, 2003, 18:473-480.2 Di Campli C, N

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