实验高效液相色谱法(2015年)

1、高效液相色谱法测定饮料中山高效液相色谱法测定饮料中山梨酸、苯甲酸和糖精钠梨酸、苯甲酸和糖精钠 1.掌握高效液相色谱法测定饮料中糖精钠、苯甲酸和山梨酸的原理和方法 2.熟悉高效液相色谱仪的使用方法 3.了解高效液相色谱仪的仪器结构 目的与要求目的与要求 方法原理方法原理 在适宜的条件下,高效液相色谱可同时分离饮料中的糖精钠、苯甲酸、山梨酸。样品超声超声除去二氧化碳和乙醇,调pH至近中性,过滤后进高效液相色谱仪,经反相C18 液相色谱分离后,紫外检测器230nm波长处检测。 以色谱峰的保留时间保留时间定性定性,利用色谱峰面积色谱峰面积在一定范围内与浓度呈线性关系进行定量定量1.仪器仪器: 高效液相

2、色谱仪,配备二极管阵列检测器; 超声波清洗仪; 50ml容量瓶;50ml烧杯;50l微量进样器仪器与试剂仪器与试剂 糖精钠标准储备溶液糖精钠标准储备溶液(10.0mg/ml): 准确称取于120烘干4h后的糖精钠(C6H4CONNaSO22H2O)0.5000g,加水溶解 后定容至50ml 苯甲酸标准储备溶液苯甲酸标准储备溶液(5.0mg/ml): 准确称取0.2500g,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶解, 定容至50ml 山梨酸标准储备溶液山梨酸标准储备溶液(5.0mg/ml): 准确称取0.2500g山梨酸,加碳酸氢钠溶液25ml,加热溶 解,定容至50ml 标准混合使用液标准混合使用液

3、(含糖精钠1.0mg/ml,苯甲酸0.5mg/ml,山梨酸0.5mg/ml):准确吸取各标准储备溶液5.0ml,加水定容至 50ml2.试剂试剂: 稀氨水(1+1);碳酸氢钠溶液:20g/L;甲醇(色谱纯)2.2.配制标准系列配制标准系列: : 取9只50ml容量瓶分别编上号码,按下表配制标准系列。 混合标样中各物质的浓度混合标样中各物质的浓度1.样品处理样品处理:吸取10.0020.00ml汽水,放入50ml烧杯中, 超声除去二氧化碳,用稀氨水调pH7.0,加水定容至50ml,用滤膜(0.45m)过滤,备用。 操作步骤操作步骤 1.插好电极,打开电源开关,按模式键切换到pH测量状态 2.用两

4、点法进行校正(b=2)(pH 4.01,6.86,9.18)3.按模式进入b=24.将电极浸入标准缓冲液中(pH=6.86),按“校正”,当到达 终点时显示屏上显示相应校正结果;将电极放入第二种 标准缓冲液(pH=4.01或9.18),按“校正”,当到达 终点时 显示屏上显示相应校正结果;按“读数”,保存校正结果 并退回到正常的测量状态5.将电极插入到被测液中,调节pH到所需值pH计的使用计的使用(1)过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。前处理前处理滤膜类型：滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，

5、酸和盐醋酸纤维滤膜：醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水溶剂尼龙尼龙6666滤膜：滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可以用于强酸，不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：再生纤维素滤膜：同样适用于水溶性样品和有机溶剂3.测定测定色谱条件色谱条件: 色谱柱:C18 ,4.6mm150mm;流动相流动相: 甲醇-0.02mol/L乙酸铵溶液(5+95);流速流速:1ml/min 检测波长检测波长:230nm 取样品处理液和标准系列溶液各10l注入高效液相色谱仪进行分离,以其标准溶液峰的保留时间为依据进行定性。以标准溶液的浓度为横坐标,相应的峰面积为纵坐标,分别绘制标准曲线(或计算回归方

6、程),从标准曲线上查出(或根据回归方程求出)样液中被测物质的含量,按下式计算:V0 xVCC式中: Cx为样品中被测物的含量,g/kg C 为在标准曲线上查得的相对应的糖精钠、苯甲酸、山梨酸的含量,mg/ml V0 为样品定容体积,ml V 为取样体积,ml思考题思考题1.为什么被测溶液需要除去二氧化碳?2.采用230nm为测定波长,对样品中山梨酸的测定有何影响？ 注意事项注意事项 1.流动相使用前必须经过脱气。如果流动相中含有气体,在较高的柱压下会产生气泡,使流动相流动受阻,对分离样品产生不利影响2.应通过预实验调整和最后确定流动相实际配比,以使各分析组分的分离效果最佳3.被测溶液pH值对测

7、定和色谱柱使用寿命均有影响,以中性为宜4.苯甲酸、糖精钠的灵敏波长为230nm,山梨酸灵敏波长为254nm,在此波长测定时苯甲酸和糖精钠的灵敏度较低,因此采用230nm为测定波长(2)脱气：脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动A.示差折射率检测器 *使折射率变化B.UV检测器（200nm以下） *溶解氧气有吸收 C. 荧光检测器 *溶解氧气有消光作用1. 吸气器法（流动相抽滤） *可以抑制制做流动相时产生的气泡 *只是暂时的脱气法 *不能解决因溶解气体造成

8、的问题2. 超声脱气法3. 使用氟树脂膜的减压脱气法溶剂前处理溶剂前处理-脱气脱气使用超声波震荡器，一般超声震荡 15 分钟左右注意流动相在超声震荡脱气过程中，温度会升 高，应待其降至室温后再上机使用。由于液体对气体的溶解作用，时间长后气体会 再溶入流动相中，应引起注意。溶剂前处理溶剂前处理-脱气脱气溶剂前处理溶剂前处理- -脱气脱气使用氟树脂膜的减压脱气法氟树脂膜氟树脂膜真空室真空室真空泵真空泵流动相流动相往送液泵往送液泵缓冲液的使用使用前必须过滤使用后一定要进行清洗，以免造成腐蚀、磨损、阻塞: 用含5%甲醇的水溶液冲洗30min（1ml/min），再用甲醇冲洗30min用纯水冲洗泵头清洗管

9、路 易受到细菌和霉菌的影响不能直接用有机溶剂冲洗缓冲盐溶液缓冲液流动相的更换不互溶的流动相不能直接更换缓冲盐不能直接用有机溶剂更换水正己烷异丙醇缓冲盐有机溶剂水液相色谱简易流程图输输液液泵泵进样进样器器 色色谱谱柱柱柱温箱柱温箱检测检测器器溶溶剂剂数据数据处处理理废液废液液相系统维护流程图吸滤头吸滤头单向阀单向阀柱塞密封圈柱塞密封圈线路过滤器线路过滤器手动进样器手动进样器检测器检测器色谱柱色谱柱泵工作示意图 凸轮柱塞杆柱塞密封圈单向阀 泵头流动相入口流动相入口流动相出口流动相出口LC-20AT串联式柱塞往复泵串联式柱塞往复泵LC-20AD 并联式微体积柱塞往复泵并联式微体积柱塞往复泵柱塞泵的基

10、本结构 LC-10ATvp LC-10ADvp 单向阀单向阀单向阀1_at.flv1_ad.flv单向阀单向阀结构球座吸液冲程排液冲程出口单向阀进口单向阀泵头抛光面宝石球流动相单向阀工作原理单向阀结构请不要分解阀心A和阀心B重新组装后性能不被保证，输液可能不稳定注意：线路过滤器故障：堵塞现象：系统压力偏高措施：异丙醇（或5稀硝酸）， 超声波清洗判断依据：关闭排液阀，断开出口管路，设定流速1mL/min，如压力0.5MPa，则堵塞。排液阀压力传感器线路过滤器流动相线路过滤器部件号：部件号：228-32744228-32744Minutes0246810121416182022mAU020406080100120140空白样品色谱图空白样品色谱图 混合标准品色谱图混合标准品色谱图 Minutes02