分子生物学技术

1、精选优质文档-倾情为你奉上分子生物学技术近年来，心血管疾病的发病率和死亡率急剧增加，已成为危害我国人民群众生命和健康的重大疾病。人们逐渐认识到,包括心血管疾病在内的许多疾病的生理、病理机制的本质问题是相关基因的表达及其调控。随着研究的深入, 心血管疾病的研究已深入到分子生物学水平。人们寻找疾病相关基因, 研究其表达调控机制, 希望在分子水平阐明疾病发生机制, 以期更有效地进行疾病的诊断、治疗。相应地, 很多分子生物学研究技术也应用到对心血管疾病的研究中来, 成为不可或缺的基本手段, 如分子杂交技术、聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction，PCR）技术、反义核酸技术

2、、DNA 微阵列、转基因技术等等。分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性生物大分子和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据的一门学科。1953 年 Watson & Crich 发现 DNA 双螺旋结构, 标志着分子生物学时代的到来。随着研究的进展, 人们对心血管疾病的研究也逐步深入到分子水平, 很多分子生物学的研究技术也在疾病机理、药物机理的研究中广泛应用, 成为基本的研究手段。人类基因组计划完成后, 生命科学研究进入后基因组时代, 进行功能基因组学、蛋白质组学的研究, 相应的实验技

3、术也广泛应用并不断发展。 在过去的短短的10余年中,检验医学发展日新月异、发展迅猛,临床实验室的实验设备已高度自动化及网络化，“实验室全自动化”（Total Laboratory Automation,TLA）、分子诊断（MolecularDiagnostics）、床旁检验（Point of Care Tests,POCT）、循证检验医学（Evidence basedlaboratory medicine,EBLM）的兴起为心血管疾病的诊疗提供了极大帮助。 1、 分子生物学技术由于分子生物学技术的快速发展,以及人类基因组序列认识的逐渐完善,以PCR为代表的体外核酸扩增技术已在临床基因诊断中得以

4、较为广泛的应用,如病毒、细菌的基因快速检测,遗传性疾病的诊断,肿瘤的基因诊断等。实时荧光定量PCR技术的应用,不仅使临床基因检测更加快速,而且使基因检测进入定量阶段,这特别有利于某些疾病治疗效果的评价。免疫检验中的放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA）,酶免疫分析（Enzyme Iimrrmnoassay，EIA）,金标记免疫分析,荧光免疫分析（Fluoroimmunoassay，FIA）,时间分辨荧光免疫分析（Time-resolved Fluoroimmunoassay，TRFIA）,化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）

5、,电化学发光免疫分析（Electro-Chemiluminescence Immunoassay ，ECLI）技术的临床应用不仅拓宽了免疫学检测的领域,同时提高了免疫学检测的灵敏度,促进了免疫检测的自动化。特别是化学发光免疫分析、电化学发光免疫分析技术的诞生,使得免疫学检验进入了一个新的时代,检测灵敏度可达pg水平,其检测速度、分析自动化程度及分析准确性也是其它免疫学方法无法比拟的。流式细胞术进入临床实验室极大地拓宽了临床检验的范围,可应用于细胞DNA、RNA定量及细胞周期分析、细胞表面标志物分析、凋亡细胞的检测等,促进了细胞生物学的临床应用。 生物芯片技术是生命科学研究中继基因克隆技术、基因

6、自动测序技术、PCR技术后的又一次革命性技术突破。生物芯片已在高通量基因测序、基因表达研究已经发挥了其重要作用,也将在后基因组时代研究蛋白质功能及蛋白质间的相互作用方面发挥其极其重要的作用。由于生物芯片具有高通量、可同时快速检测多种待检分子的特点,故研究适用于临床实验诊断需要的低密度生物芯片近年来已成为检验医学的研究热点之一,用于肝炎病毒、HPV检测及分型、结核分枝杆菌、人巨细胞病毒、幽门螺杆菌、地中海贫血、性传播性疾病等的检测及诊断的基因芯片已相继问世;用于微量蛋白质、激素、肿瘤标志物监测的蛋白质芯片也已得到初步应用。 分子诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及

7、其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。分子诊断以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”针对性强。目前已经能够进行分子诊断的疾病包括:染色体疾病的诊断和产前筛查。单基因遗传病的分子诊断和产前诊断。单基因遗传疾病是由单个基因发生突变引起的疾病。已发现的人类单基因遗传病多达400种以上。目前,已经了解许多单基因遗传疾病的致病基因以及发病机制,如Marfan综合征、先天性肾上腺皮质增生症、糖原累积症、家族性高胆固醇血症。多基因疾病的分子诊断。多基因疾病是危害人类健康的多发病、常见病,如恶性肿瘤、心血管疾病（动脉粥样硬化、高血压等）、糖尿病、精神-心理疾病（精神分裂症、忧郁症等）。这些疾病

8、的分子病因十分复杂,可采用已知基因标志的连锁分析和关联分析方法,对未患病个体进行患病危险性预测,以及对上述疾病进行亚型的基因分型和鉴定等辅助诊断,以利于疾病的正确治疗。感染性疾病的基因诊断。恶性肿瘤的分子诊断。 二、心血管疾病检测常用的分子生物学技术心血管疾病是一种与多基因有关的复杂疾病，其发生、发展与多基因位点变异及表达异常有关。高血压、冠心病等心血管疾病, 是由于环境与遗传因素相互作用引起, 涉及多基因的参与, 机制复杂, 分离与克隆相关基因是了解这些疾病机理的基础。研究相关细胞和组织在生理、病理或药物处理状态下的基因表达谱, 分析基因表达差异, 可以为筛选疾病候选基因, 阐释疾病的机理提

9、供重要信息。分子诊断的常用技术方法有：核酸分子杂交技术，包括Southern印迹（Southern blot杂交），Northern印迹（Northern blot杂交），斑点杂交（dot blot），原位杂交（insituhybridization）等；PCR及相关应用技术，包括等位基因特异寡核苷酸探针（Allele Specific Oligoneucliotides，ASO）杂交法、单链构象多态（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP）分析、DNA限制性片段长度多态性（Restrictionfragment Length Polymorp

10、hism，RFLP）分析、微卫星DNA分析技术等。基因测序是基因突变检测的最直接最准确的方法它不仅可确定突变的部位还可确定突变的性质。基因组学及分析技术，包括基因芯片、DNA微阵列（DNA microarray）技术等，利用核酸分子杂交原理，可用于大规模筛选和基因表达研究。蛋白质组学及分析技术，作为功能基因组研究的重要支柱，研究的是在不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体，从而揭示和说明生命活动的基本规律。荧光原位杂交染色体分析技术（FISH），这项实用技术不仅可用于基因在染色体上的定位研究，而且可直接用于实验室诊断。波谱核型分析技术（Spectral karyotyping，SKY）主要用于

11、肿瘤细胞的遗传学分析，检测复杂的细胞遗传学异常，也可用于比较细胞遗传学的种间进化差异性研究等方面。分子生物学相关技术的发展及作用，其中应用较多的有：一是毛细管电泳技术（capillary electrophoresis，CE）现已广泛应用于病原体、肿瘤和遗传病的基因诊断，如病原体特异基因检测、基因突变检测、序列分析等；二是液质联用质谱技术（LC/MS/MS），可在短时间内通过检测血液中氨基酸或酰基肉碱水平异常可快速筛选出近30种基因遗传性代谢紊乱疾病在多肽、激素、寡核苷酸以及药物成分分析等方面应用广泛；三是变性高效液相色谱技术，可自动检测单碱基替代及小片段核苷酸的插人或缺失。（一）DNA 微阵

12、列（ DNA microarrays） DNA微阵列（DNA microarrays）广泛应用于基因的序列分析、基因组图谱分析、基因突变与基因多态性分析以及疾病的基因诊断等方面。1999年基因微阵列技术应用于心血管系统的研究以来,在心血管病相关基因差异表达分析、疾病分子分型、基因突变检测和多态性分析等方面取得了一些进展。 DNA微阵列也叫DNA芯片、基因芯片（genechip），将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上,产生二维DNA探针阵列,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效的检测或医学诊断。由于常用硅芯片作为固相支持物,运用了计算机芯片的制备技术,所

13、以称之为基因微阵列或基因芯片技术。其基本原理是分子杂交,类似于Southern和Northern印迹杂交技术,通过探针与固定于芯片上的大量cDNA、表达序列标签（Expressed Sequence Tags，EST）或寡核苷酸的杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量，具有高通量、简便、微缩、集约化、平行化等优点。 基因表达谱芯片和基因诊断芯片是基因芯片的两种重要形式,前者可以提供待测组织的基因表达谱,即组织中基因整体的表达情况;后者则主要是通过检测疾病相关基因突变或者表达改变等信号来诊断疾病的发生。 人类共有35000多个基因,2001年哈佛大学附属医院心血管研究中心用3种统

14、计方法确定了26000多个与人类心血管系统有关的基因,结果表明与人类心血管系统有关的基因占人体基因的3/4,这也是全世界第一次建立这样的基因库。并确定了200多个与心功能衰竭有关系的病态基因。心血管系统生理功能和病理改变的分子机制十分复杂,与心血管系统生理和病理过程相关的信号转导系统也是一个综合的调控网络,其状态的描述是传统的单因素研究理论和方法所不能承担的,需要借助复杂系统的研究理论和方法来完成。而以往对心血管疾病的研究,都是采取一种疾病用一个基因检测的传统方法,存在诸多不便,不能满足当前医学领域飞速发展的需求。而微阵列芯片利用高度集成的cDNA/EST片段或寡核苷酸微阵列,使大规模、高通量

15、同时检测成千上万种组织或细胞内的基因的表达成为可能,达到了一定意义上的全基因表达谱的检测。EST是长150500bp的基因表达序列片段,EST技术是将mRNA反转录成cDNA并克隆到载体构建成cDNA文库后,大规模随机挑选cDNA克隆,对其5或3端进行一步法测序,所获序列与基因数据库已知序列比较,从而获得对生物体生长发育、繁殖分化、遗传变异、衰老死亡等一系列生命过程认识的信息。心血管系统基因组DNA数目庞大,含有重复序列和非编码序列,如完全采用克隆筛选和排列的方法获得其编码基因序列,大量的时间和精力将被消耗在模板DNA的制备上。因此采用此技术在短期内即得到大量来自cDNA文库的表达序列,即表达

16、标签序列（ESTs）,将其制备成ESTs微阵列是目前寻找和发现新基因及心血管疾病相关基因的快速有效方法。 目前,在心脏的研究中,微阵列芯片技术主要用于检测心肌重塑模型（包括缺血损伤、拟神经递质/激素刺激造成的心肌重塑和不同发育阶段的心肌重塑等模型）的基因表达谱、病毒性心肌炎的针对治疗及心血管疾病的基因表达差异与病理状态下分子机制的研究等方面。 DNA微阵列技术近年被应用于冠状动脉疾病、心肌梗死、心衰和一些先天性心脏病的研究中, 用来比较患者的基因表达差异, 也用于研究内皮细胞、血管平滑肌细胞、免疫细胞在心肌梗死、冠状动脉疾病中的变化。 （二）基因表达序列分析（Serial Analysis o

17、f Gene Expression, SAGE） SAGE 技术最初由 Velculescu 等人建立, 与微阵列技术一样, SAGE 技术可同时扫描上千个基因的表达, 可获得完整的转录谱, 是一个非常有效的分析基因表达的方法。 SAGE 技术基本原理是, 在一个基因转录本内部特定位置上, 有能代表一个基因的短序列标签,多个 SAGE 标签连结在一起, 连到克隆载体上, 测序。每个 SAGE 标签理论上代表一个转录本, 基因表达差异可以通过比较特定 SAGE 标签在不同文库间表达丰度的差异来表示。相对于微阵列技术,SAGE 在心血管疾病研究中的应用还是较为有限。 目前, 正常人心脏的 SAGE

18、 文库已经建立, 也有报道建立了正常鼠心脏的基因表达谱。在心血管发育、动脉粥样硬化、脂代谢调节等许多领域都可应用 SAGE 技术。在 Schwartz 等的研究中, 利用 SAGE 技术识别鼠心脏血管紧张素（ANG）调节靶位点, 发现了一些新的 ANG调节靶位点。（三）代表性差异分析 （representational difference analysis of cDNA, cDNA RDA） Hubank 等 1994年建立 cDNA RDA 技术。之后 cDAN RDA 被广泛应用于各个领域的基因克隆, 如肿瘤特异基因、分化相关基因、器官特异基因、刺激信号诱导表达基因等。这项技术的原理为

19、: 用识别4个碱基的限制性内切酶对双链cDNA进行消化, 理论上将产生平均大小为256bp 的DNA片段, 因此细胞中绝大多数表达的基因至少有两个酶切位点, 即产生一个两端带有可识别和处理的末端片段, 可以进行后续的扩增、消减、富集等操作。在对心血管疾病的研究中, 如内皮细胞, 动脉硬化斑块等, 也有RDA技术的应用。Tyson 等应用RDA方法研究正常人和动脉粥样硬化患者血管中基因表达差异, 发现了包括炎症反应、免疫反应的相关基因在内的31个差异表达的基因, 为粥样硬化形成机理的免疫反应学说提供证据。（四）蛋白质组学方法 蛋白质组（proteome）指一个细胞或一种组织基因组所表达的全部蛋白

20、质。是由 Wilkins 在 1994 年首先提出, 并于 1995 年首次在文献中阐述。蛋白质组学方法是通过对比正常细胞与不同处理条件下的细胞或疾病细胞蛋白质表达谱的不同, 发现不同情况下蛋白质表达的变化, 是一种在蛋白质水平的差异显示。该技术基本方法为: 样品制备; 蛋白质的分离, 常用分离方法有双向凝胶电泳（2- DE）、离子交换、分子筛法、高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳、质谱（MS）等技术; 蛋白质成像; 蛋白质的鉴定: 在分离及检测之后, 要进行蛋白质鉴定。蛋白质组学技术在心血管疾病研究中广泛应用。研究者已在心血管蛋白质组研究中识别了能量代谢相关蛋白、细胞骨架蛋白、热休克蛋白

21、等多种蛋白质的变化。在扩张型心肌病的分子机制方面, 已发现近100 种心肌在扩张型心肌病的心肌中蛋白质明显减少, 大致分为三类: 细胞骨架及肌纤维蛋白, 与线粒体及能量产生相关的蛋白, 与应激反应相关蛋白。 在对心血管疾病中平滑肌细胞机能紊乱的研究中, 也有蛋白质组学方法的应用。Dupont 等用2- D 方法研究动脉平滑肌细胞, 发现患者中有 83个细胞内蛋白、18 个分泌蛋白表达不同。Mayr 等应用 2- D 与 MS 研究 PKC delta 对血管平滑肌细胞的作用, 结果 PKC 缺少的细胞中有 30 种以上的蛋白质改变, 包括涉及葡萄糖代谢、脂代谢的酶,及谷光甘肽循环、细胞骨架相关

22、蛋白。证明 PKC delta 在葡萄糖代谢、脂代谢、控制细胞氧化还原态、SMC 细胞分化的过程中是关键调节因素。在基因表达分析方法中, 没有一种方法能够适合于所有要研究的问题, 需要根据所研究问题的特点, 选择不同的方法, 也可以将几种方法结合使用。上文中的几种技术都有自己的缺点, 包括成本问题、灵敏度问题、操作复杂等。具体实验中还需根据不同目的、不同实验许可条件进行选择。另外, 新技术的出现往往会带来科学研究的巨大进展, PCR 技术就是一个很好的例证, 因此, 发展新技术也是科学研究中一个不可忽视的重要方向。（五）第二代测序技术的发展随着二十世纪中期 DNA 双螺旋结构的发现，至今生命科

23、学可谓是在半个世纪的时间里进行了迅猛的发展，人类对自己的机体了解程度越来越深刻，对于疾病的认识需求也越来越迫切，利用遗传信息来了解疾病，更是从源头来了解疾病本身，并由此延伸出多个学科。进行基因组学研究最基础的技术手段是DNA 测序技术，在双螺旋结构发现后，科学家迅速展开了对测序技术的研究，第一代测序就是在这样的背景下出现的，上个世纪七十年代先后出现了两种测序技术，产生了划时代的影响，其中一种是至今为止还在使用并且做出突出贡献的 sanger 测序法，是由 Frederick Sanger 发明的，称为双脱氧链终止测序法。另外一种是化学讲解法，由 Walter Gilbert 发明。虽然第一代测

24、序在发明之后的时间里为人类基因组学研究贡献了不可磨灭的贡献，完成了很多相关基因组学研究工作，其中规模庞大人类基因组计划（Human Genome Project，HGP），前后跨越两个世纪，将近 13 年时间，耗费 30 亿美元，集中了全球最顶尖的生物学专家，仅仅是完成了单个人体的基因组图谱。由此可以看出，第一代测序存在着耗时长、耗费大等问题，不适合大规模应用于人类疾病的基因组学研究。进入二十一世纪之后第二代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）得到飞速发展，尽管 NGS 在 2004 年才开始得到商业应用，但是它已经有能力影响到我们对全基因组生物学问题的探索

25、，并且在短短的几年时间，已经有超过 100 项关于 NGS 的技术平台被开发出来，这些技术不仅仅耗时短、耗费低、通量高，而且也加速促进人类对测序数据读取的多样性需求，使 DNA 测序技术大规模应用人类疾病研究成为了可能，因此 NGS 完全彻底地改变了我们对基因组学的研究，开放了许多新的研究领域，包括始祖基因的探索、生物多样性的特征描述以及复杂疾病未知病因的识别等等，并且随着 NGS 的迅猛发展，与此相关的生物信息学技术也随之快速发展。经过几年的发展，目前应用于大规模并行测序的主流平台主要包括：Roche公司的 454 FLX、Illumina 公司的 Solexa Genome Analyze

26、r/HiSeq System 和美国应用生物系统公司 the Applied Biosystems SOLiDTM System。这三家公司研发的NGS 平台代表了目前高通量测序技术水平，也是应用最为广泛的主流平台。如表 1-1 所示，这三种技术有着各自的特点。表 1-1 第二代测序技术的比较Table 1-1 Comparison of Next-Generation Sequencing Systems.测序平台测序原理读长精确度测定序列输出数据量时间454 FLX焦磷酸测序700bp99.9%1M0.7Gb24 小时50bp(SE)Solexa边合成边测序50bp(PE)98%3G600

27、Gb310 天100(PE)50+35bp or7 天(SE)SOLiD连接法测序99.9%1200M120Gb50+50bp14 天(PE)注：SE=Single-end; Paired-end=PE; bp=base pair作为第一个商业化应用的第二代测序平台，Roche 公司的 454 FLX 系统采用的是焦磷酸测序技术。其基本原理是：在每一轮的核苷酸合成中通过加入DNA 聚合酶导致焦磷酸盐的释放，从而引起一系列的下游反应，最终依靠荧光素酶等生物酶产生可捕捉的光学信号。具体过程如图 1-1 所示。从图 1 和表 1我们可以看出，焦磷酸测序技术的特点是：它的读长可以达到 700bp，准确

28、率为 99.9%，并且 24 小时内就可以完成 0.7Gb 的数据输出量，最突出的优点就是速度和核酸读取长度，但是数据产出量与另外两种测序平台相比较少，并且高额的费用也是 454 平台广泛使用的一个挑战。图 1-1 焦磷酸测序技术原理NGS 还可以应用于肿瘤标志物的检测、感染性疾病的诊断及耐药性检测。目前已经应用于医学临床检测的项目包括：遗传性肿瘤易感基因检测、个体化用药指导、无创产前 DNA 检测、新生儿遗传代谢病筛查以及单基因遗传病检测等。1997 年牛津大学的研究团队首次从孕妇血浆中提取到胎儿DNA，并应用于性别诊断。DNA 测序技术发展至今，针对胎儿利用 NGS 进行无创产前诊断技术已

29、经成功应用于临床，降低了不良胎儿的出生率。对于乳腺癌患者来说，如果能够在发病早期通过 NGS 检测到 BRCA 基因高表达，就可以及时给与干预，甚至使患者得到治愈的机会，Feliubadaló 的研究团队已经证实 BRCA 基因的突变会导致乳腺癌的发生，也是目前较为准确的 NGS 预测疾病发生的应用之一。曾经造成较为严重公共卫生问题的 H7N9 流感病毒是由中国卫生部病原体系统生物学重点实验室研究人员通过 NGS 技术鉴定发现的。靶基因治疗药物注射用曲妥珠单抗，又名赫赛汀，已经成为人类表皮生长因子受体 2(human epidermalgrowth factor receptor-2

30、, HER2)过度表达的转移性乳腺癌的一线用药，并且逐步开展的临床试验表明在许多上皮性肿瘤中，如果 HER2 表达过高，赫赛汀是适用的，可以有效提高患者的生存率。三、分子生物学技术在心血管疾病中的应用（一）在筛查心血管疾病中的应用 基因筛查并非金标准，发现突变并不能完全预测、预后或确诊，因为有些致病細携带者可能终生不发病尤其是错义突变，需要进一步进行功能研究。但是基因筛查相对于临床诊断有很好的时效性，可以在发病前或在出现严重临床事件前及时采取相应的预防措施，降低猝死率。每一种检查都有一定的特异度和灵敏度，不能将各种疾病不完全外显造成假阳性而完全否定基因诊断的前景，存在致病基因突变有进一步发展致

31、病的易感性，因此对于这部分病人建议进行跟踪随访。尽管目前研究还不能明确肯定特定基因突变对患者临床及预后的价值，但基因筛查对心血管患者的诊断和临床治疗仍具有不可估量的意义。 应用分子诊断技术进行疾病筛查，可以实现目前的诊断治疗模式，转向预测预防及个体化模式。应用分子诊断技术，可对部分心血管疾病进行筛查。青少年猝死的常见原因为肥厚型心肌病。深入了解肥厚型心肌病的遗传基础对理解这种最常见的心血管遗传疾病及给予最适合的处理具有重要意义。肥厚型心肌病发病涉及的基因有很多种，每种基因的突变部位又分布在不同的外显子及内含子上，因此，对肥厚型心肌病进行人群筛选必须寻找一种经济方便的方法。应用分子诊断技术进行基

32、因筛査改变了传统的肥厚性心肌病（Hypertrophic Cardiomyopathy，HCM）诊断方法，患者可以不依赖心室肥厚，而在发病以前就可以得到诊断（临床前诊断）。2010年Voelkerding等人报道：应用新一代测序技术（Next generation sequencing，NGS）为肥厚性心肌病的筛查及诊断提供了新方法。学者们用长片段PCR技术扩增HCM中的基因片段，发现Myosin，heavy chain 6、7（MYH6、7）、Myosin，light chain 2、3（MYL2、3）等16个基因中共有个突变点可以用来筛查HCM，提高了疾病筛查的敏感性。现在的研究也表明，致

33、心律失常性右室心肌病（Arrhythmogenic Right Ventricular Cardiomyopathy，ARVC）是一种桥粒病桥粒功能异常是致病的最后通路，非桥粒基因可能通过影响桥粒发挥作用，而非桥粒基因迄今为止发现的家系及突变数目有限，因此建议先筛査桥粒成分基因，可对ARVC进行筛查。2013年Campuzano等人针对家族中有成员发生心脏性猝死的15个西班牙家族进行基因检测及全身体格检查后发现DSP-p.Q986X的遗传变异对致心律失常性右室心肌病的发生具有预示意义。对于原发性高血压，尽管没有一个研究能够明确的易感基因但是针对多个基因的多个单核苷酸多态性进行筛查分析，可以实现

34、在分子生物水平预防和治疗原发性高血压。（二）在诊断心血管疾病中的应用对不同的疾病需要采用不同的基因诊断策略以求达到最佳的诊断效能。目前分子诊断技术对于心血管疾病的基因诊断，主要应用于以下几个方面：1免疫法检测转录因子免疫法检测转录因子是将预先制备好的与相应转录因子特异结合的双链DNA通过核酸粘附液包被于酶链板孔中，与待测样品充分反应后，进行相应转录因子的免疫反应及显色反应，从而达到检测核转录因子活性的目的。本项分子诊断技术中DNA的包被不需特殊的预活化试剂和特殊的表面，具有包被省时、检测过程简便、无需特殊的仪器设备、适合作高通量检测、无放射性污染、灵敏度高和定量准确等优点。与心脏发育、生长相关

35、的遗传因素可直接导致许多心脏疾病的形成。转录因子Nkx2.5是心脏前体细胞分化的最早期标志之一，与心脏发育密切相关，Nkx2.5基因突变导致先天性心脏病的发生。2013年Huang通过免疫法和基因及基因功能分析发现，转录因子Nkx2.5基因上游增强子的两个杂合DNA变异序列对小部分室间隔缺损的先天性心脏病发挥作用，通过这样的遗传研究能为先心病的治疗提供策略。2聚合酶链反应法检测外显因子 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特

36、异性DNA片段。因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断等诸多方面。 GATA-4基因与先天性心脏病关系密切在心脏的发育过程中发挥着重要作用，它的单个或多个基因的突变及异常表达均可能会导致心脏畸形的发生，如房间隔缺损、法洛四联症、室间隔缺损等，应用PCR技术对血液标本中GATA-4基因3，4，5，6外显子对引物进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶中电泳，可进行定性定量分析，即可对冠心病（Coronary Heart Disease，

37、CHD）进行诊断。另外，2013年最新研究发现，Wei等人通过PCR技术发现GATA-5基因中有两个杂合突变位点p.R187G和p.H207R，均可导致法洛四联症的发生，并为人法洛四联症的早期预防和等位基因治疗法提供策略。3基因单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）检测 SNP是一种最常见的可遗传变异，可分为两种形式，一是基因编码区的SNP，称为cSNP；二是遍布于基因组的大量单碱基变异，已广泛地应用于疾病的连锁分析及关联分析、肿瘤的杂合性缺失研究、疾病遗传机制研究、个性化用药研究等诸多领域。例如ARVC可以对PKP-2、TGFB-3和DSP等相

38、关突变基因进行单核苷酸多态性检测，分析基因型的差异，以探讨其基因多态性与疾病的相关性。也可以将检测结果通过与人类基因组序列多态性数据库（dbSNP）进行序列比较，选择相应的多态性位点并在家系其他成员中进行序列测定和比较分析，可得出相应的结论。4基因突变检测 根据心血管疾病相关的目标基因，提取病人基因组DNA，可应用基因扩增和单链构象多态分析（PCR-SSCP）等分析技术，与正常对照组比较，即可对突变基因进行检测。同时，还可将扩增产物上高效液相色谱技术（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）进行分析，与正常组比较，分析其差

39、异性，只要存在差异便可认为有异常。PCR-SSCP是在不测序情况下检测核酸变异的敏感方法。SSCP突变检出敏感性35%100%不等，当DNA片段长度在300bp以内时，SSCP分析检测基因突变的准确性为90%100%。采用SSCP分析与毛细管电泳方法相结合技术，结果可使基因突变的检出敏感性达100%，并具有高通量检测的优点。例如，对先天性长QT综合征（CLQTS），可对其中的LQT1-3（KCNQ1、KC-NH2、SCN5A）等相关突变基因进行检测，分析基因型的差异，即可对这种遗传学心肌病进行诊断。5致病基因DNA测序DNA测序技术使直接检测核苷酸突变成为可能，而不仅仅是基因片段的多态性分析使

40、临床分子诊断更加精确。常用于探针设计、特异引物合成、基因结构分析等，在遗传病诊断、微生物种属鉴定、肿瘤诊断等领域广泛应用，人类基因组计划就是由于大规模自动化测序技术的发展而顺利完成的。但由于DNA测序方法复杂一般临床实验室无法进行，有必要时可委托有条件的公司或研究机构进行。各种基因序列可由Genbank上获得，根据基因序列设计特异性引物，进行基因扩增，扩增产物可以进行测序检测，通过与人类基因组序列数据库（Build 36.3）进行序列比较也可将测序结果与正常序列进行比对即可得出结果。目前大部分遗传性高血压的基因诊断多依赖于直接的DNA测序技术，通过对致病基因的序列分析，可发现导致基因功能异常的

41、各种形式的突变。6DNA甲基化检测很多研究显示，基因表观遗传学的改变与动脉粥样硬化有着密切的关系，例如诱导同型半胱氨酸含量升高，可以改变人血管平滑肌细胞DNA甲基化的改变，从而导致动脉粥样硬化的发生，异常的DNA甲基化使血管平滑肌细胞增殖，并从中膜迁移至内膜参与形成动脉粥样硬化斑块。除全基因组甲基化的变化与冠心病相关，一些特异性的基因甲基化也影响动脉粥样硬化的进展，如雌激素受体基因、P53基因、细胞外超氧化物歧化酶基因等。通过对动脉粥样硬化相关的DNA甲基化水平进行检测，即可了解动脉粥样硬化的进程。常用的甲基化检测方法有：限制性内切酶法、亚硫酸氢盐处理法和DNA芯片技术等。同样的方法可以应用于原发性高血压的诊断。7miRNA检测 miRNA参与调控动脉粥样硬化相关因素，包括内皮细胞的生长、分化、死亡和凋亡，以及内皮祖细胞、炎症细胞、细胞因子、脂质的调节等，从而促进动脉粥样硬化的发生发展。对相关的miRNA进行检测，可对动脉粥样硬化的发生、发展及预后进行诊断，目前国内外miRNA检测方法主要有：miRNA芯片、高