组织DNA提取原理和步骤详细（课堂PPT）

1、1组织组织DNADNA提取提取Tissue DNA ExtractionTissue DNA Extraction 实验目的实验目的 v学习从生物组织中提取学习从生物组织中提取DNADNA，为研究为研究DNADNA的理化的理化性质与结构功能打好基础。性质与结构功能打好基础。提取提取DNADNA总的原则：总的原则：1 1 保证核酸一级结构的完整性；保证核酸一级结构的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；污染应降低到最低程度；3 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过

2、高浓度的金属离子；剂和过高浓度的金属离子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也应尽量去除。也应尽量去除。粉碎组织粉碎组织DNPDNP 裂解液裂解液 裂解细胞膜、核膜裂解细胞膜、核膜DNPDNP 苯酚、氯仿苯酚、氯仿 DNADNA（RNARNA） RNA RNA酶酶 Protase Protase 苯酚、乙醇苯酚、乙醇 纯纯DNA DNA 紫外定量紫外定量原理：原理：各种组织细胞破碎方法各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学

3、法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母破裂细胞破裂细胞 、释放核酸、释放核酸DNA酚抽提法示意图DNADNA鉴定鉴定(DNA identification)(DNA identification) 浓度鉴定浓度鉴定(concentration)(concentration) 纯度鉴定纯度鉴定(purity)(purity) 完整性鉴定完整性鉴定(integrity)(integrity)浓度鉴定浓度鉴定(concentration identification)(concentration identification)1 1）紫外分光光度法）紫外分光光度法(ultra

4、violet spectrophotometery)(ultraviolet spectrophotometery) 测定测定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。 A A260260稀释倍数稀释倍数5050 g/mlg/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.250.25ug/mlug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于1时，相当于50g/ml双链DNA， 40g/ml单链DNA或RNA，20g/ml单链寡核苷酸） 各种碱基的紫外吸收光谱各种碱基的紫外吸收光谱2 2）荧光光度法）荧光光度法 荧光染料溴化乙锭（荧光染料溴化乙锭（e

5、thidium bromideethidium bromide，EBEB），可嵌），可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。呈正比。 适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-51-5ngng）EB与DNA的结合500 l全血提取的基因组全血提取的基因组DNA电泳电泳动物组织提取基因组动物组织提取基因组DNA纯度鉴定纯度鉴定(purity identification)(purity identification)紫外分光光度法：紫外分光光度法： 在在260260nmnm和和280280nmnm处测定

6、处测定DNADNA溶液的光吸收，纯的溶液的光吸收，纯的DNADNA， A A260260与与A A280280之比应在之比应在1.801.80；低于此值表明制备物中留有蛋；低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有白质成份。高于此值表明有RNARNA的残留量。的残留量。 纯的纯的RNA ARNA A260260与与A A280280之比应在之比应在2.02.0。 A260/A280A260/A280比值是纯度检测的重要指标。比值是纯度检测的重要指标。完整性鉴定完整性鉴定(integrity identification)(integrity identification)凝胶电泳法：凝

7、胶电泳法： 基因组基因组DNADNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；泳图谱脱尾现象； 总总RNARNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNARNA降解；如降解；如加样槽中存在条带，可能是加样槽中存在条带，可能是DNADNA污染。污染。核酸的贮存核酸的贮存DNADNA保存保存 (storage)(storage)1 1）短期贮存：）短期贮存： 4 4或或-20-20存放于存放于TETE（tristris和和EDTAEDTA）缓冲液中。缓冲液中。 TETE缓冲液的缓冲液的pHpH与与DN

8、A DNA 贮存有关，贮存有关，pHpH为为8 8时，可减少时，可减少DNADNA脱氨反应，脱氨反应，pHpH低于低于7.07.0时时DNADNA容易变性。容易变性。2 2）长期贮存：）长期贮存： TETE缓冲液中缓冲液中-70-70保存数年；在保存数年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。可有效防止细菌和核酸的污染。每克组织每克组织 + + mlml裂解液裂解液 组织匀浆器，匀浆组织匀浆器，匀浆取取2.0ml2.0ml匀浆，加等体积苯酚匀浆，加等体积苯酚- -氯仿，摇匀氯仿，摇匀5 5minmin，2,500rpm 10min2,500rpm 10min

9、 取水相取水相加等体积氯仿加等体积氯仿- -异戊醇异戊醇, ,摇匀摇匀5 5min, 2,500rpm 10minmin, 2,500rpm 10min方法：方法： 取水相取水相 加加5 5M NaClM NaCl至终浓度至终浓度0.30.3M NaCl, M NaCl, 加加2.52.5倍体积倍体积冰无水乙醇冰无水乙醇 ，摇匀，摇匀 见白色沉淀见白色沉淀, ,玻棒挑起玻棒挑起 DNA DNA 70% 70%乙醇洗涤乙醇洗涤一一次次沉淀溶于沉淀溶于1ml TE1ml TE 适当稀释适当稀释紫外分光光度计测紫外分光光度计测A A260nm260nm,A,A280nm280nm 吸取吸取DNADN

10、A原液原液 ll，用用ddHddH2 2O O稀释至稀释至 l l ，在紫外分光光度计上测定在紫外分光光度计上测定A A260nm260nm及及A A280nm280nm，计算计算A A2 6 0 n m2 6 0 n m/ A/ A2 8 0 n m2 8 0 n m比 值 及比 值 及 D N AD N A 浓 度 。浓 度 。 一 般 以一 般 以A260nm/280nm1.8A260nm/280nm1.8为标准。为标准。 A260nm/A280nm A260nm/A280nm若若1.61.6，提示有蛋白质或，提示有蛋白质或酚污染，应进一步纯化。酚污染，应进一步纯化。定量定量DNADNA

11、浓度（浓度（g/mlg/ml）= =A A260nm260nm 50 50 稀释倍数稀释倍数 1/ 1/光径光径* *1 1ODOD值相当于值相当于5050g/ml dsDNAg/ml dsDNA，40g/ml ssDNA40g/ml ssDNA或或RNARNA，2Og/ml2Og/ml寡核苷酸。寡核苷酸。浓度计算浓度计算1.1.裂解液（裂解液（Homogenization bufferHomogenization buffer）: : 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 1mmol/L EDTA 0.1mo

12、l/L NaCl 0.1mol/L NaCl 1%SDS 1%SDS EDTAEDTA: :抑制抑制DNADNA酶活性酶活性试剂及其作用试剂及其作用SDSSDS是是离子型表面活性剂离子型表面活性剂，主要，主要功能功能：溶解细胞膜蛋白而破坏细胞膜；溶解细胞膜蛋白而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白；解聚细胞中的核蛋白；与蛋白形成复合物与蛋白形成复合物2.2.苯酚苯酚- -氯仿氯仿( (Phenol-Chloroform):Phenol-Chloroform): 苯酚：苯酚：强蛋白变性剂强蛋白变性剂 氯仿：氯仿：蛋白变性剂蛋白变性剂，与水不互溶，与苯酚，与水不互溶，与苯酚 互溶，互溶，可以带走残余的酚

13、可以带走残余的酚。 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNADNA的分离？的分离？ 苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于由基，直接用于DNADNA分离，会使磷酸二酯键断裂，分离，会使磷酸二酯键断裂，造成造成DNADNA降解。降解。 氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Tris-HclTris-Hcl饱和酚，并调节至中性。饱和酚，并调节至中性。3.3.氯仿氯仿- -异戊醇异戊醇（Isoamyl-alcoholIsoamyl-alcohol）：）： 能降低分子表面

14、张力能降低分子表面张力，所以能减少抽提过，所以能减少抽提过程中泡沫的产生，同时程中泡沫的产生，同时异戊醇有助于分相，异戊醇有助于分相，使使离心后的上层水相、中层变性蛋白质及下层有离心后的上层水相、中层变性蛋白质及下层有机溶剂相维持稳定。机溶剂相维持稳定。4.4.冰无水乙醇（冰无水乙醇（Absolute ethonalAbsolute ethonal）和和70%70%乙醇乙醇(70% (70% Ethonal):Ethonal):v无水乙醇无水乙醇会夺去会夺去DNADNA周围的水分子，周围的水分子，使使DNADNA失去水失去水而易于而易于聚合聚合；可；可除去残余的氯仿除去残余的氯仿。v70%70

15、%乙醇乙醇洗涤可洗涤可去除残余的盐离子去除残余的盐离子，盐离子的存，盐离子的存在会使之不易溶解，并可抑制酶反应。在会使之不易溶解，并可抑制酶反应。5.5.TE TE 缓冲液缓冲液 （TE BufferTE Buffer）：）： 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 1mmol/L EDTA缓冲对缓冲对Tris-HClTris-HCl不存在金属离子的干扰作用不存在金属离子的干扰作用EDTAEDTA能稳定能稳定DNADNA的活性的活性。6.20%6.20%SDSSDS（十二烷基磺酸钠）：十二烷基磺酸钠）： 抑制抑制

16、DnaseDnase活性活性 7.107.10mg/mlmg/ml蛋白酶蛋白酶K(Protase K)K(Protase K)： 分解蛋白质，破坏细胞膜分解蛋白质，破坏细胞膜 8.108.10mg/mlRNAmg/mlRNA酶酶( (RNase)RNase)：分解分解RNARNA9. 59. 5mol/L NaClmol/L NaCl： 减少减少DNADNA分子间的同性电荷相斥力，使分子间的同性电荷相斥力，使DNADNA易于易于相反相反聚合聚合而形成而形成DNADNA钠盐沉淀。钠盐沉淀。DNADNA提取试验中常遇到提取试验中常遇到的问题的问题v 基因组基因组DNADNA收率较低或无基因组收率较

17、低或无基因组DNADNA 样本材料太少样本材料太少 细胞破裂不够充分，细胞破裂不够充分，DNADNA释放不完全释放不完全 离心力偏小离心力偏小 两相分离不完全两相分离不完全 v DNADNA降解的原因降解的原因 样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本不够新鲜，采集材料过陈旧 样本本身存在大量样本本身存在大量DNADNA酶酶v 提取提取DNADNA的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？ 提取的基因组提取的基因组DNADNA盐浓度过高盐浓度过高 基因组基因组DNADNA中乙醇未清除净中乙醇未清除净 基因组基因组DNADNA中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素v 提取基因组提取基因组DNADNA，有时加入蔗糖的原因有时加入蔗糖的原因 加入多糖，保护加入多糖，保护DNADNA长度长度 注意事项注意事项 1.1.处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中处死动物取出所用脏器后应尽快放入液氮中, ,以以免免DNaseDNase引起引起DNADNA降解。在纯化过程中要加核酸降解。在纯化过程中要加核酸酶抑制剂酶抑制剂( (eg.EDTA),eg.EDTA),以防以防DNADNA自身降解。自身降解。2.2.组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解组织要尽量研磨得细一点，颗粒太大细胞裂解不彻底，在随后过程