一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究

1、一体化层状梯度修复体用于骨软骨组织工程的实验研究         08-06-27 16:55:00     编辑：studa20               作者：白雪东，胡蕴玉，严乐平，任力，吴刚，李丹，孙效棠，白建萍【摘要】  目的探索胶原/壳聚糖/纳米磷酸三钙一体化层状梯度修复体在组织工程中用作骨软骨缺损修复的可行性。方

2、法以型胶原、壳聚糖、纳米磷酸三钙（TCP）为基本原料，采用无毒交联并通过冷冻干燥法成型；扫描电镜观察，测定支架材料的孔径、孔隙率以及交通孔情况；分离扩增兔骨髓间充质干细胞（BMSC），将BMSC接种于材料上，扫描电镜观察细胞在材料上的黏附状态，MTT法测定细胞在材料上的生长曲线；以软骨诱导液体外诱导细胞支架复合物向软骨分化，2周后植入自体股部肌袋，6周取材，HE、甲苯胺蓝染色、型胶原免疫组化鉴定诱导分化效果。结果材料疏松多孔，孔径大于100m，孔隙率大于95。细胞在材料上黏附状态良好，并且增殖迅速。BMSC材料复合体经体外三维诱导后可在自体异位向软骨分化。 结论型胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化

3、层状梯度修复体具有良好的孔隙结构和生物相容性，有望成为一种新型的组织工程支架材料用于骨软骨缺损修复。 【关键词】  组织工程； 骨软骨； 骨髓间充质干细胞； 胶原； 纳米磷酸三钙    Abstract：ObjectiveTo explore the potential of a novel collagen I / chitosan /Nanotricalcium phosphate(TCP)bilayered scaffold for being used in tissue engineering(TE)of osteochondral repai

4、r.MethodBilayered scaffolds were produced with collagen ,chitosan andTCP,using a special crosslinking and freeze drying method.The pore size,porosity and interpores of the scaffold were observed by scanning electron microscopy(SEM).Rabbit bone mesenchymal stem cells （BMSC）were isolated and amplified

5、,then inoculated onto the scaffold.By SEM scanning,the condition of the cells adhering onto the scaffold was observed.The proliferation of the cells on the scaffolds was examined using MTT method,and the growth curve was drawn.The cellscaffold composite were then induced to differentiate towards car

6、tilage by 3D culturing,and then implanted into muscle pouches 2 weeks later.The result was observed 6 weeks later by HE staining,toluidine blue staining and type collagen immunohistochemistry.ResultThe scaffold possessed high porosity and proper pore size,the porosity was above 95%.BMSC could adhere

7、 onto the scaffold well,and the proliferation rate of the cells on the scaffolds was perfectly good.After in vitro induction,BMSCscaffold composite can differentiate toward cartilage ectopicly.ConclusionThe novel collagen I / chitosan /TCP bilayered scaffold possesses good pore structure and biocomp

8、atibility,and will possibly become a new biomaterial of TE used for osteochondral repair.    Key words：tissue engineering(TE);  osteochondral;  bone mesenchymal stem cells(BMSC);  collagen;  Nanotricalcium    组织工程学的发展为软骨损伤修复提供了新的方法，可有效地解决移植物来源以及供区损伤问

9、题，并且移植物可以在体外任意塑形，以适应损伤部位的需要1。软骨缺损的修复包含2个主要方面：（1）以功能性修复组织填充缺损；（2）修复组织与周围宿主软骨和骨的整合2。目前软骨组织工程中存在的一个突出问题是移植物与宿主组织间缺乏稳固的锚定，单纯依赖软骨软骨界面微弱的连接往往难于达到满意的修复效果3。    为有效解决移植物与宿主组织的整合问题，作者研制了一种新型组织工程骨软骨一体化材料胶原/壳聚糖/TCP一体化层状梯度修复体。该材料在结构上分为上层的软骨部分和下层的软骨下骨部分，但整个材料一体化交联，避免了软骨与骨部分在修复过程中分离。凭借骨组织之间快速而牢固的整合，

10、有望使整个修复体在早期稳固地锚定于缺损区，为关节软骨的修复提供良好的稳定性和机械支持。    本实验对该组织工程骨软骨一体化修复体的一般性能以及体外生物相容性进行了研究，并且通过体外诱导以及自体异位实验初步探讨其用于组织工程骨软骨损伤修复的可行性。    1  材料和方法    1.1  胶原/壳聚糖/纳米TCP一体化层状梯度修复体的研制    支架材料由华南理工大学生物材料研究所研制提供，以型胶原、壳聚糖为基材,与具有良好生物活性的TCP粉体共混交联，经

11、冷冻干燥成型。上层为胶原/壳聚糖，下层为胶原/壳聚糖/TCP，无机粉体含量由下到上呈梯度变化。    1.2   支架材料的形态和孔隙率    以排水法测材料的孔隙率，扫描电镜观察材料的孔隙大小以及孔隙贯通情况。    1.3   MTT法测细胞在支架材料上的增殖活性    取3个月龄日本大耳白兔，体重2.1 kg，常规麻醉消毒后自胫骨平台下0.5 cm处以18号穿刺针穿刺，两侧各抽取骨髓23 ml，小心加入预装有等体积percoll工

12、作液（密度1.073）的离心管，以2 000r/min离心25 min后收集有核细胞层，重悬于含10新生牛血清（GIBCO）的高糖DMEM培养液中，接种于100 ml培养瓶，于37 、体积分数为5 CO2的孵箱中培养。3 d后首次换液，以后每23 d换液，待原代细胞80%铺满瓶底时传代。    取第2代细胞，胰酶消化后制成3.0×105个/ml的细胞悬液。在48孔板内放置20块同等型号的材料，以滴注法将细胞悬液接种于材料，每块材料150 l；另将5块材料以单纯培养液滴注用做对照。培养箱内静置4 h后，每孔加入培养液700 l以充分覆盖材料，18h待细胞完

13、全贴壁后，将复合有细胞的材料转移至新孔，每孔加培养液1.5 ml，以后每2 d给予换液。分别在转孔后第2、4、6、9和12 d随机选取3块复合细胞的材料和1块对照材料，每孔加入700 l培养液和70 l 5 mg/ml的MTT溶液，于培养箱内4 h后吸弃各孔内液体，并在各孔加入700 l DMSO，微量振荡器上振荡10 min后，每孔吸取150 l液体加入96孔板用作检测。选择492 nm波长，以对照孔调零，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值。以时间点为横坐标，各时间点MTT均值为纵坐标绘制生长曲线。    1.4   扫描电镜观察细胞在材料上

14、的黏附状态    将细胞悬液以3.0×105个/ml的密度接种于支架材料，置24孔板内培养12 d后以3%的戊二醛固定，梯度酒精脱水，叔丁醇置换，真空干燥，离子喷射仪喷金，扫描电镜下观察细胞在材料表面及内部的黏附形态。    1.5   MSCs在支架材料上的诱导分化    取3个月龄日本大耳白兔，体重22.5 kg，依上述方法分离扩增兔BMSC。取第2代细胞，消化后配成2×106个/ml的细胞悬液，将细胞悬液在24孔板内接种于支架材料，每块材料150 l，于培养箱内静置4 h后，加2 ml培养液继续培养。24 h后将材料转移至新孔，并将培养液更换为以高糖DMEM配制的成软骨诱导液(含rhTGF1 10g/L，地塞米松1×107 mol/L，VitC 50 g/L，新生牛血清100 ml/L)，以后每2 d换液。持续诱导培养14d后，将实验动物常规麻醉消毒，分别切开股部皮肤、皮下及筋膜，沿肌纤维走行钝性制造肌袋。左侧植入空白载体为对照侧；右侧植入经诱导的细胞-支架复合体为实验侧。术后6周后取材，制成石蜡切片行HE、甲苯胺蓝染