加味四逆散对血吸虫病小鼠肝纤维化相关因子表达的影响

1、加味四逆散对血吸虫病小鼠肝纤维化相关因子表达的影响【摘要】 目的 观察加味四逆散对血吸虫病肝纤维化小鼠透明质酸(HA)、血清型前胶原(PC)、羟脯氨酸(Hyp)及转化生长因子-1(TGF-1)mRNA表达的影响。方法 NIH小鼠经皮肤人工感染血吸虫尾蚴后随机分为4组：模型组(B组)、吡喹酮组(C组)、吡喹酮+加味四逆散组(D组)、吡喹酮+秋水仙碱组(E组),同时设正常对照组(A组)。病理观察小鼠肝组织,于肝纤维化形成后第21日开始灌服相应药物及生理盐水,C、D、E组在第45日时予以吡喹酮一次性灌胃进行杀虫,第78日小鼠心脏采血用放免法测定血清PC和HA含量,取肝组织匀浆测定Hyp含量;RT-P

2、CR检测TGF-1 mRNA的表达。结果 HA水平D组高于A组,低于B、C、E组(P<0.01,P<0.05);PC水平D组低于B、C、E组(P<0.05);Hyp水平D组高于A组,低于B、C、E组(P<0.05);TGF-1 mRNA表达D组低于B、C、E组(P<0.05)。结论 加味四逆散联合吡喹酮能有效改善血吸虫病小鼠肝纤维化,降低TGF-1 mRNA的表达。 【关键词】 血吸虫病;肝纤维化;加味四逆散;透明质酸;血清型前胶原;羟脯氨酸;转化生长因子-1;小鼠Abstract：Objectives To evaluat

3、e the effect of Modified Sini Powder on the hepatic expression of hyaluronic acid (HA), procollagen peptide (PC), hydroxyproline (Hyp) and transforming growth factor- (TGF-1) in a murine model of liver fibrosis induced by Schistosoma japonicum infection. Methods The NIH mice were successfully induce

4、d to liver fibrosis by infection with Schistosoma japonicum and then randomly divided into model group (group B), praziquantel group (group C), praziguanted plus Modified Sini Powder group (group D) and praziquantel plus colchicine group (group E). The mice in groups C, D and E were treated with pra

5、ziquantel, praziquantel plus Modified Sini Powder and praziquantel plus colchicine, respectively. In addition, a group of unfected NIH mice (group A) served as normal control. Histological specimens were stained with HE. Expression of TGF-1 mRNA was determined by RT-PCR and the content of Hyp in liv

6、er was measured by ELISA. Radioimmunoassay technique was employed to detect the serum content changes of HA and PC. Results The levels of HA, PC, Hyp and TGF-1 mRNA in group D were markedly lower than those in group B, C and E (P<0.05). Conclusion Modified Sini Powder combined with praziquant

7、el can implove liver fibrosis due to Schistosoma japonicum, perhaps by down-regulating the expression of TGF-1 mRNA.Key words：schistosomiasis;liver fibrosis;Modified Sini Powder;HA;PCIII;Hyp;TGF-1;mice血吸虫病最主要的病理改变是虫卵肉芽肿和肝纤维化,肝纤维化是肉芽肿的间接延伸,是影响患者生活质量与导致死亡的主要原因。前期我们临床采用加味四逆散治疗慢性血吸虫病肝硬化取得了一定疗效。为探讨其治疗机理,

8、我们以加味四逆散对血吸虫病小鼠肝纤维化形成过程进行干预,观察其对血吸虫病肝纤维化小鼠透明质酸(HA)、血清型前胶原(PC)、羟脯氨酸(Hyp)及转化生长因子-1(TGF-1)mRNA表达的影响。现将结果报道如下。1 实验材料1.1 动物NIH小白鼠,雌雄各半,体重(20±2)g,鼠龄68周,湖南中医药大学实验动物中心提供,合格证号：SCXK(湘)2009-0004。1.2 药物与试剂加味四逆散浓缩水煎剂：枳实、柴胡、白芍、甘草、丹参各10 g,上述药物一次性从湖南中医药大学附属第一医院药房购入。2次水煎浓缩,药物浓度为100%(原药材含量1 g/mL)。秋水仙碱水溶液：秋水仙碱,0.

9、5 mg/片,购自中国医药集团上海化学试剂公司,批号060515,用时以生理盐水配成水溶液(0.013 mg/mL)。吡喹酮溶液：吡喹酮片,200 mg/片,皖卫药准字1996第100260号,淮南市第三制药厂生产,批号0311201,用1%羧甲基纤维素钠溶液配成20 mg/mL的悬液(湖南省血吸虫病防治研究所何永康教授赠送)。1.3 钉螺阳性钉螺共60只,湖南省寄生虫病防治研究所何永康教授赠送。2 实验方法2.1 孵育血吸虫尾蚴将阳性钉螺置于25 环境下饲养10 d后放入平皿内,用25 脱氯水清洗3次,取活钉螺56只,放入50 mL烧杯内,用尼龙纱罩住加满脱氯水,置28 环境,用50 W灯光

10、照射,静置4 h左右,可见水面上有大量尾蚴游动。2.2 造模小鼠仰卧固定在木板上,剪去腹毛,面积约1.5 cm×1.5 cm,暴露皮肤,用脱氯水将腹部皮肤浸湿。在盖玻片上蘸取少许疫水,光学显微镜观察计数尾蚴,将有尾蚴的一面贴放在小鼠腹部皮肤上每鼠感染(26±2)条静置3 min,取下盖玻片,小鼠放回鼠笼饲养。2.3 分组给药与处理方法感染后小鼠随机分为模型组(B组)、吡喹酮组(C组)、吡喹酮+加味四逆散组(D组)、吡喹酮+秋水仙碱组(E组),同时设正常对照组(A组)。自感染后第19日每组随机抽取2只小鼠,解剖观察肝组织的嗜酸性脓肿,肝门静脉血吸虫成虫数量,并病理切片观察肝纤

11、维化,病理证明肝组织纤维化后第21日开始治疗。D组每鼠灌服加味四逆散浓缩水煎液0.2 mL/次,每日2次;E组每鼠灌服秋水仙碱溶液0.2 mL/次,每日2次;A、B、C组灌服生理盐水0.2 mL/20 g,连续24 d。各治疗组于第45日,给予吡喹酮300 mg/kg一次性灌胃进行杀虫,3 d后各组小鼠继续按原给药方案治疗。第78日小鼠最后1次给药后,均禁食不禁水24 h,心脏采血,剖取肝组织备检。2.4 血清肝纤维化指标检测采用上海海洋研究所医学生物技术中心提供的试剂盒放免法测定HA、PC含量。2.5 肝组织羟脯氨酸含量测定取右叶肝组织匀浆,离心,取上清,按照南京建成生物工程研究所提供的测试

12、盒说明书测定肝组织Hyp含量。2.6 转化生长因子-1 mRNA表达常规RT-PCR方法进行。TGF-1多克隆抗体及兔抗鼠SP试剂盒为北京中山生物制品公司产品;Trizol(GIBCO公司);反转录酶MMLV,Oligo(dT)18,Tac酶,MixdNTP(Promega公司);RNA酶抑制剂(大连宝生物工程有限公司);TGF-1基因引物由上海生物工程制品公司合成;TGF-1基因引物序列为：上游5-TGAGTGGCTGTCTTTTGACG-3,下游5-ACTTCCAACCCAGGTCC TTC-3,扩增产物350 bp。-actin：上游5-TGACTCAAGATTGTCA GCA A-3下

13、游5-AGATCCACAACGGATACATT-3,扩增产物450 bp。扩增产物经2%琼脂糖凝胶,25 mV、50 mA下电泳。电泳结果经Eagle Eye 凝胶成像分析系统(美国)扫描仪扫描成像。用Multi-Analyst software package进行PCR产物半定量分析TGF-1 mRNA相对含量。3 统计学方法应用SPSSl4.0软件进行统计,数据以±s表示。组间均数比较采用方差分析;组间两两比较,方差齐采用LSD检验,方差不齐则采用DunnetT3检验。P<0.05表示差异有统计学意义。4 结果(见表1)表1 各组小鼠HA、PC、Hyp含量及TGF-

14、1 mRNA表达比较5 讨论肝星状细胞(HSC)是产生细胞外基质(ECM)最重要的细胞,各种原因导致肝损伤引起ECM合成增加、降解减少,造成肝内ECM不断积聚,最后导致肝纤维化甚至肝硬化1。ECM主要包括胶原蛋白、蛋白多糖、层粘连蛋白、纤维连接蛋白等。HA由间质细胞合成,PC是合成肝脏型胶原的前体,二者含量均随肝纤维化严重程度而上升,是肝纤维化血清学指标。Hyp为胶原纤维所特有,测定肝组织Hyp的含量可提示肝胶原蛋白的含量变化,也可作为肝纤维化参考指标2。TGF-是一族结构相关、功能相似的活性多肽,在肝内主要由HSC产生,TGF-在合成及分泌时都无生物活性,必须活化并与受体结合后才能发生作用。

15、TGF-被活化后有三种亚型,即TGF-1、TGF-2及TGF-3,其中TGF-1是关键的致纤维化因子,对肝纤维化形成过程中相关细胞的激活以及ECM的异常过度沉积有重要病理作用3。He YT等4实验表明,中药和硒能抑制大鼠肝组织TGF-1的表达,对肝纤维化具有保护作用。四逆散由枳实、柴胡、白芍、甘草组成,可透邪解郁、舒肝理脾,具有邪去郁解,气血调畅,清阳得升,化逆自愈之功效。方中柴胡能引药入肝经;枳实疏肝理气;白芍柔肝止痛;甘草调和诸药;丹参具有活血化瘀止痛之功效,其含有的活性成分丹酚酸A具有良好的抗氧化作用,能抑制成纤维细胞增生,降低细胞内胶原合成率,丹酚酸B盐有良好抗纤维化疗效,能干预TGF

16、-1在HSC内的信号转导与细胞活化5。本实验结果表明,加味四逆散能有效降低肝纤维化相关因子HA、PC、Hyp及TGF-1 mRNA的表达,从而发挥治疗血吸虫病肝纤维化的作用。【参考文献】 1 杨悦杰,黄芬.肝星状细胞及相关细胞因子在肝纤维化形成中的作用J.世界华人消化杂志,2007,15(27)：2885-2890.2 朱彩平,袁冬生,石磊,等.加味四逆散抗大鼠肝纤维化的实验研究J.热带医学杂志,2008,8(4)：317-319.3 Gressner AM, Weiskinrchen R. The tightrope of therapeutic surppresion of active transforming growth factor-：high enough to fall deeplyJ. Hepatol,2003,39：856-859.4 He YT, Liu DW, Ding LY, et al.Therapeutic effects and molecular mechanisms of anti-fibrosis