同种异体骨髓间充质干细胞复合胶原海绵修复兔桡骨缺损的实验研究

1、同种异体骨髓间充质干细胞复合胶原海绵修复兔桡骨缺损的实验研究                      作者：杨柏林，潘勇，云雄，邹重文，曹国永【摘要】  目的：了解兔骨髓间充质干细胞(BMscs)同种异体移植的存活分布情况及同种异体兔BMscs复合胶原海绵(CS)情况，观察其对兔桡骨1.5 cm缺损的修复效果，为将来的进一步应用奠定实验基础。方法：采集、培养、纯化扩增新西兰大

2、白兔BMscs，用eGFP荧光标记BMscs，与胶原海绵联合培养，植于同种异体动物臀大肌，观察存活及分布情况。建立兔桡骨缺损(1.5 cm)模型，45只新西兰大白兔随机分为3组：同种异体BMscs/CS组(A组)，单纯胶原海绵组(B组 )，空白对照组(C组)。术后分阶段行X线、组织学检查及生物力学检查，评价其修复效果。结果：eGFP标记的BMscs异体移植存活时间超过3周。X线示12周A组大白兔5只中有4只达到骨性连接。新生骨量呈A组C组递减，至12周无一愈合。随着时间推移，A组编织骨髓腔和骨小梁增多，修复过程优于B、C组。A组生物力学指标均低于健侧正常对照组，但各指标能达到正常组的80%90

3、%。结论：同种异体MSCs复合CS可以修复1.5 cm兔桡骨缺损。 【关键词】  骨髓间充质干细胞;组织工程;移植;骨缺损             ABSTRACT Objective:To study the survival and distribution of allogenic mesenchymal stem cells (BMscs) after implantation into other rabbits, evaluate osteog

4、enetic effectiveness of collagensponge mixed with allogenic BMscs of rabbit in repairing of radial shaft defects, and lay the foundation for further application.Methods: The BMscs of New Zealand white rabbits were collected，cultured，purified and amplified，they were marked with eGFP, cultured with co

5、llagensponge and planted into ectogluteus of other rabbits in order to observe the survival and distribution of BMscs. Model of radial bone defects (15 mm )of rabbits was established. 45 rabbits were divided into 3 groups, group A (BMscs/CS group), group B (CS group) and group C (untreated group). R

6、oentgenographic, histologic, biomechanics indexed of the animals were examined at certain time after surgery to evaluate osteogenetic effectiveness.Results: The BMscs marked with eGFP could survive for 3 weeks. On the 12th week, 4 of 5 radial bone defects healed in group A.The quantity of callus dec

7、reased from group A to C. In group B and C, no one rabbits healed on the 12th week. Biomechanics result showed the indexes of group A were lower than the opposite side normal control groups.Conclusion: BMscs mixed with CS can repair radial defect shorter than 1.5 cm in rabbit.KEY WORDS Bone marrow m

8、esenchymal stem cells; Tissue engineering; Transplant; Bone defects利用组织工程的方法骨缺损，是目前骨科基础研究的热点之一。目的基因、种子细胞、支架材料是组织工程三大要素，种子细胞作为其中一项要素引起了广泛的研究1，2，其中骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells， BMscs )是研究较多的种子细胞之一。传统的自体细胞移植在实验室研究阶段存在着大量细胞取材困难，宿主存活时间难以保证，不同宿主细胞容易混杂污染等缺点。研究发现BMscs可有效绕过机体的免疫排斥进行异体移植，基于此本文将

9、异体BMscs复合胶原海绵，对兔1.5 cm桡骨缺损修复进行了实验研究。1 材料与方法1.1 材料优质胎牛血清(杭州四季青公司);DMSO(上海生化试剂二厂);MTT(美国Sigma公司);Percoll分离液(密度1.073 g/mL，天津TDB公司);DMEM/F12培养基(美国Gibco公司);胰蛋白酶(美国Amesco公司);注射用肝素钠、注射用链霉素、速眠新(华北制药股份有限公司);胶原海绵(北京益而康公司)新西兰大白兔(第三军医大学大坪动物中心);eGFPAd由重庆武警总队医院曹国永博士提供。1.2 方法将上述方法获得的eGFPAdBMscsCS复合材料取出，PBS清洗，2.5%戊

10、二醛固定，乙醇和丙酮梯度脱水，和CS一起临界点干燥后喷金，扫描电镜观察。评分标准如下：新生骨面积百分比1%24%计1分;25%49%计2分;50%74%计3分;75%99%计4分;100%计5分。2 结果2.1 原代BMscs 显微镜观察结果BMSC形态与成纤维细胞类似，呈纺锤形，有少量细胞突起。随着换液的进行，出现集落状细胞群，由1020个细胞组成，此后细胞集落迅速增多，融合成片，呈旋涡状排列， 912 d细胞铺满瓶底成单层，见图1。图1 倒置显微镜下原代BMscs图象(×100)2.2 胶原海绵及eGFPAdBMscsCS复合体扫描电镜观察结果胶原海绵疏松多孔，大小不均。复合材料

11、扫描观察见BMscs在CS支架材料上伸展良好，细胞融合成片状，细胞与周围材料紧密相连，少数成球形(图2)。2.3 eGFP标记的BMscs体内示踪观察结果术后3 d，冰冻切片在荧光显微镜下可见移植区大量eGFP阳性细胞。术后7 d可见少许减弱，在胶原海绵外周边组织亦发现有少许eGFP阳性细胞。3周后荧光明显减弱，5周后消失。2.4 X线观察结果A组：4周时缺损处少许骨痂生长，8周时大量骨痂形成。12周时，5例中有4例有连续骨痂通过，新生骨塑形改建。B、C组：4周时缺损处空虚，至12周仍无1例愈合，形成骨不连。但B组骨痂多于C组。见图3。图2 胶原海绵及EgfpAdBMscsCs复合体扫描隧道显

12、微镜图像(×700)1         图3 A、C组X线图像X线骨形成评分结果显示，4周时A、B、C组评分值分别为(3.8±0.5)、(0.8±0.4)和(0.7±0.4);8周时各组评分值分别为(4.7±0.9)、(1.5±0.5)和(1.0±0.0);12周时分别为(4.3±0.4)、(1.5±0.5)和(1.0±0.0)，在各时间点A组评分均高于B、C组，且差异有统计学意义(P<0.05);B、C组间评

13、分值差异无统计学意义(P>0.05)。2.5 组织学观察结果A组修复过程4周时以纤维骨痂和软骨组织为主，含大量软骨细胞;8周时编织骨开始增多，出现骨小梁，部分标本出现髓腔;12周时髓腔和骨小梁进一步增多，但髓腔内骨髓细胞少见。B、C两组修复过程类似，可见纤维组织增生,12周时缺损区填充纤维组织，仅有少量骨组织形成，最后缺损处形成纤维连接(见图4)。图4 A、C组组织修复图像2.6 生物力学测定A组的最大载荷、抗压强度和弹性模量分别为(87.8±9.8)N、(8.4±0.9)Mpa及(187.5±8.2)Gpa，均低于健侧组(112.3±11.2)N

14、、(9.5±0.2)Mpa及(210.5±15.9)Gpa，且结果有统计学意义(P<0.05)。3 讨论BMscs最初是由Friedenstein5提出，1987年Friedenstein发现一类易于贴附于塑料培养板表面的成纤维细胞样细胞，具有多向分化潜能,特定条件下可向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等细胞分化6。骨髓中MSC的数量有限,含量极低,通常105106个骨髓有核细胞中仅有1个MSC7。故如何从体外获取、纯化MSC并使其高效快速增殖成为组织工程技术应用和推广的热点问题。密度梯度离心法利用MSC与其他细胞的密度不同，用特定密度的淋巴细胞分离液将MSC

15、分离出来,该法所获得的细胞种类单一,细胞纯度高,可以满足组织工程研究的要求。本实验采用密度梯度离心法得到MSC后采用贴壁培养法，通过传代将MSC纯化,其原理如下：首先利用MSC与其他有形成分的密度不同，通过密度梯度离心法有效地将绝大部分红细胞、粒细胞、脂肪细胞和血小板除去,获得纯度较高的单个核细胞。再通过贴壁培养和换液可除去悬浮生长的血细胞。通过传代3次，本实验所看见细胞形态一致，杂质细胞少见，从而达到了有效的分离和纯化。目前,关于MSC的鉴定也无统一的标准。BMscs表面标志物具有非单一性的特性，它不表达造血谱系标志物 CD11，CD45,CD34,而表达CD44,CD71,CD9069。由

16、于其表面标志的非专一特性,目前还没有筛选到MSC特异的分子标记，其鉴别主要是综合判断10。本实验获得的细胞从形态看,MSC呈均一的成纤维细胞形态,贴壁生长为梭形、三角形,各代之间形态单一，结合其分离方法分析，符合BMscs的特征。研究还发现BMscs可有效绕过机体的免疫排斥进行异体移植，从而极大的方便了BMscs的应用。在鼠、兔等多种动物体内进行的同种异体移植试验中，均未发现明显的免疫排斥反应。在人的体外实验研究中，将取自与hBMscs供者无关的淋巴细胞与hBMscs共存培养，hBMscs并不激发T细胞增殖，反而抑制混合细胞群淋巴细胞性的反应。Lieehty11等将人BMscs体外培养后，移植

17、入妊娠早期羊胚胎囊腔内，发现人BMscs可分化出多种细胞，并且在胎羊内存活超过13个月。关于BMscs逃避宿主免疫排斥的机制可能为：(1)BMscs的低免疫原性。BMscs主要表达MHCI型分子，不表达或极少表达MHCII型分子，而MHCI型分子可以保护BMscs免受NK细胞对其造成杀伤12。(2)BMscs抑制T细胞的增殖13，或调整其表型来抑制正常的免疫排斥反应14。(3)BMscs分泌多种可溶性因子15如IL6、IL7、IL8、IL11、IL12、IL14、IL15、IL27、白血病抑制因子(leukaemia inhibitory factor)、干细胞因子( stem cell fa

18、ctor)、肝细胞生长因子(Hcpatocytc growth factor)等。这些因子可能促进了局部免疫抑制微环境的形成。同时，本实验采取深低温冻存可能改变了其表面的抗原结构，使受者对其免疫反应性下降，出现免疫耐受。实验观测示植入的BMscs可在宿主内存活3周，证实了以上观点。实验还发现植入的细胞在局部聚集，周围组织含有少量细胞，也说明了支架材料与种子细胞粘附良好，同时BMscs有一定的迁移能力，具有活跃的细胞功能。体内实验从病和影像学指标上显示了无论是在骨缺损修复速度还是新生骨成骨数量A组处理对象均超过其它组，验证了BMscs具有一定的修复骨缺损能力，而B、C组无显著性差异，这证明单纯胶

19、原海绵支架材料植入并不能修复1.5 cm兔桡骨干缺损。在A组的生物力学实验结果上，虽然力学性能实验组低于健侧正常组，但是在最大载荷、弹性模量和抗压强度上仍达正常值的78.2%，88.4%和89.3%，说明同种异体BMscs移植是一种有效的方法。但是针对具体移植后BMscs的转归和免疫学变化还有待于进一步研究。【】  1 Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC. et al.Muhilineage potential of adult human mesenchymal stem cells J. Science, 1999,284:143147.2 Jian

20、g Y, Jahagirdar B, ReinhaMt RL, et al.Pluripotent nature of adult marrow derived mesenchymal stem cells J. Nature, 2002,418: 4149.3 李冬梅,金连弘, 张宇, 等. 密度梯度离心法结合贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性J. 临床康复, 2006, 10(17):1820.4 Tsuchida H, Hashimoto J, Crawford E, et al.Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in ratsJ. Orthop Res, 2003, 21:4453.5 Friedenstein AJ, Chailakhyan PK, Gerasimov UV. Bone marrow osteogenic stem cells: in vitro cultivation and transplantation in di