人凝血酶原复合物在制备过程中凝血因子活性的检测和分析.docx

1、.论著.人凝血酶原复合物在制备过程中凝血因子活性的检测和分析张璘，刘晓，李青，张廷芬，张安山，张金，何彦林兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃省疫苗工程技术研究中心，甘肃兰州730046摘要：目的对人凝血酶原复合物在制备工艺中凝血因子效价进行检测和分析。方法对PCC制备过程中的血浆、S/D病毒灭活、冻干工艺、干热病毒灭活前和后分别取样，检测分析凝血因子U、W、IX和X效价，分别分析S/D病毒灭活、冻干工艺、干热病毒灭活前和后凝血因子效价的变化情况。分析PCC干热病毒灭活后的样品中四种凝血因子的效价比例。结果三批血浆中凝血因子1I、VD、IX和X的活性在0.8l2IU/mL之间。S/D病毒灭活前后

2、PCC冻干工艺前后PCC中四种凝血因子活性无明显变化，而干热病毒灭活后PCC中四种凝血因子活性均有明显下降。三批PCC中四种凝血因子的比例基本一致,但是凝血因子W效价较低，凝血因子II效价偏高。结论通过PCC制备工艺中凝血因子效价的检测和分析可实现良好的质量控制。关键词：凝血因子活性;人凝血酶原复合物;质量控制中图分类号：R378文献标志码：A文章编号：1005.5673(2015)06.0022.(协DOI：10.13309/ki.pmi.2015.06.006Detectionandanalysisofcoagulationfactoractivityinpreparationofhuma

3、nprothrombincomplexconcentrateZHANGLin,LIUXiao,LIQing,ZHANGTing-fen,ZHANGAn-shan,ZHANGJin,HEYan-linLanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd.,CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,GansuProvince,ChinaCorrespondingauthor:HEYan-lin,E-mail:HylinlzAbstract:ObjectiveTodetectan

4、danalyzethecoagulationfactorsinpreparationofhumanprothrombincomplexconcentrate(PCC)MethodsTheactivityofcoagulationfactorsII,VII,IX,Xwasmeasuredinthreebatchesofplasma.ThedifferencesinactivityofcoagulationfactorsII,VII,IXwasdeterminedbeforeandaftersteps,suchassolvent/detergent(S/D)inactivation,freeze-

5、dryingprocess,dry-heatingviralinactivation.TheproportionofcoagulationfactorinthePCCsamplewasalsoassayed.ResultsCoagulationfactorsII,VII,IX,Xactivityare0.8-1.2lU/mLinthethreebatchesofplasma.Thedifferenceinfourcoagulationfactoractivitywasnotsignificantbeforeandafterfreeze-dryingandS/Dtreatment,thuscoa

6、gulationfactoractivitywassignificantlydecreasedafterthedry-heatingviralinactivation.ThepropotionoffourfactorswasbasicallysameinthethreebatchesofPCC;thetiterofcoagulationfactorVIIwasrelativelow,butthatofcoagulationfactorIIwasrelativehigh.ConclusionAgoodqualitycontrolappproachcouldbeachievedbyusingdet

7、ectionandanalysisofthecoagulationfactorsinpreparationofhumanprothrombincomplexconcentrate.Keywords:Coagulationfactorsactivity;Humanprothrombincomplexconcentrate(PCC)；Qualitycontrol人凝血酶原复合物是一种供静脉输注、促进血液凝固的止血制剂，主要含有人凝血因子U、VK、IX和X。临床上PCC广泛应用于治疗乙型血友病、外科手术的止血和由肝脏疾患维生素K缺乏而继发作者简介:张璘，医学生物学工程师，主要从事血液制品生产质量控制

8、工作。通讯作者:何彦林，E-mail:Hylin-lz的凝血因子u、vn、ix和x低下或先天性缺乏凝血因子所造成的出血，以及因长期使用人凝血因子vm使机体产生了抗-人凝血因子郴因子的甲型血友病患者的出血3成。近年来，临床PCC应用量的逐年增加，而中国禁止进口血源性凝血因子产品，因此PCC的研制成功不仅能缓解国内临床用量的紧张局面，而旦提高了血浆的综合利用率。在PCC的制备过程中，凝血因子n、vn、ix和x的效价检测和分析对pcc的质量控制具有重要的意义。由于ACL7000全自动凝血仪具有功能强、准确度高、重复性好、智能程度高等优点，实验中采用了ACL7000全自动凝血仪对PCC生产过程中的关键

9、环节进行检测分析,为实现PCC良好的质量控制起到了可靠的保障作用。1材料和方法1.1试剂和设备缺乏凝血因子口、vn、ix和x血浆、APTT、PT等检测试剂均购自PacificHemostasis公司；PCC国家标准品购自中国食品药品检定研究院;硫酸鱼精蛋白购自Sigma公司；ACL7000全自动凝血仪.0.025mol/L氯化钙、凝血因子稀释液、样品杯和样品盘均购自Instrumentationlaboratory公司。1.2 凝血因子效价检测方法按照文献4人凝血因子II、VD、IX和X效价检测方法（一期法）和ACL7000全自动凝血仪说明书进行检测。1.3 PCC制备工艺和批次采用DEAES

10、ephadexA.50吸附、S/D和干热（8072h）病毒灭活的制备工艺，分别制备201403001、201403002和201303003三批PCC,规格为200IU/瓶。1.4 PCC制备过程凝血因子效价检测采取血浆、S/D病毒灭活前和后、冻干前和后、干热病毒灭活前和后样本，用一期法检测各样品中四种凝血因子的效价。1.5 分析PCC制备过程中凝血因子效价的变化分析三批PCC生产过程中血浆、S/D病毒灭活前后、冻干过程中前后和干热病毒灭活前后四种凝血因子效价。1.6 分析PCC中四种凝血因子效价的比例按照1.5项中检测的PCC干热病毒灭活后样品中四种凝血因子效价的检测结果，分析PCC中四种凝

11、血因子效价的比例。1.7统计学方法检测结果采用SPSS19.0方差分析软件进行配对t检验。2结果2.1三批血浆中四种凝血因子活性三批血浆中凝血因子口、训、IX和X活性均在0.81.2IU/mL,见表1O表1三批血浆中凝血因子ii、vh、ix和x活性检测结果Tab.1Thedetectedresultofcoagulationfactors11,VII,IX,Xactivityfromthreebatchesofplasma批号凝血因子效价（岫L）n圳IXX2014030010.961.050.770.892014030010.981.200.820.942014030011.061.200.8

12、80.982.2S/D病毒灭活前后凝血因子效价变化三批均0.05,表明S/D病毒灭活前后四种凝血因子的PCCS/D病毒灭活前后四种凝血因子效价的P值效价无统计学意义。表2S/D病毒灭活前后凝血因子效价检测结果Tab.2ThedifferenceofcoagulationfactortiterbeforeandafterS/Dinactivation凝血因亍201403001201403002201403003S/D前S/D后S/D前S/D后S/D前S/D后II效价(IU/mL)51.250.538.1VII效价(IU/mL)29.830.122.020.129.028.

13、1IX效价(IU/mL)31.328.921.319.924.021.2X效价(IU/mL)42.842.732.532.738.539.72.3冻干工艺过程前后凝血因子效价变化三批0.05,表明冻干前后四种凝血因子的效价无统计学PCC冻干工艺前后四种凝血因子效价的P值均意义。表3冻干工艺前后凝血因子效价检测结果Tab.3Thedifferenceoftiterforcoagulationfactorbeforeandafterfreeze-dryingprocess凝血因子201403001201403002201403003冻干前冻干后冻干前冻干后冻干前冻干后II效价（IU/瓶）35035

14、2387377330321vn效价（iu/瓶）204202230200214201IX效价（IU/瓶）284266293278279261X效价（IU/瓶）2892853073102572632.4干热病毒灭活前后凝血因子效价变化PCC中四种凝血因子活性在干热后的P值均0.01,表明干热前后四种凝血因子效价有显著性统计学意义,尽管干热后凝血因子效价有所下降，但是干热后凝血因子效价仍然符合中国药典三部2010版的要求。表4干热病毒灭活前后凝血因子效价检测结果Tab.4Thedifferenceoftilerforcoagulationfactorbeforeandafterdry-heating

15、viralinactivation凝血因子201403001201403002201403003干热前干热后干热前干热后干热前干热后II效价（IU/瓶）352264377275321244vn效价（iu/瓶）202131200138201147IX效价（1U/瓶）266194278220261198X效价（IU/瓶）2851973102422631972.5PCC中四种凝血因子比例分析三批PCC中四种凝血因子的比例基本一致,但是凝血因子vn效价较低，凝血因子n效价偏高。三批pcc中四种凝血因子的比例分析见图1。图1三批PCC中四种凝血因子比例分析图Fig.1Analysisofpropotio

16、nforfourcoagulationfactorfromthreebatchesPCC3讨论PCC的效价测定早期采用限量法，其测定结果只能表示PCC中所含凝血因子的总效价。近年来，随着检测方法的不断完善,PCC的效价测定可以准确测定出其中四种凝血因子的效价。凝血因子效价的测定方法经历了从最初的手动秒表计时法到现在的半自动凝血仪测定法和全自动凝血仪测定法的发展，全自动凝血仪测定法是全自动样品的稀释计时和计算，结果准确可靠，为PCC的质量控制提供了方便。田倩等'采用CA-500全自动血凝仪对人凝血酶原复合物凝血因子活性测定的影响因素进行了研究,PCC前处理条件、测定稀释剂、制品所含的盐离

17、子浓度、测定标准品及不同厂家的试剂均影响其凝血因子的活性，在检测过程中应予重视。李青等对ACL7000全自动凝血仪检测人凝血因子IX效价的影响因素进行了研究，结果显示最优Ca：离子浓度为0.0125mol/L,硫酸鱼精蛋白中和肝素后，凝血因子效价受稀释倍数影响较小。对于凝血因子类产品的制备，原料血浆的质量控制极为重要，原料血浆采集、储运和融浆过程等均会影响血浆中凝血因子的活性。因此，实验中首先分析了三批血浆中凝血因子u、vn、ix和x的活性在0.8l.2IU/mL之间。为进一步考察工艺过程对PCC中凝血因子活性的影响，实验中还检测分析了冻干工艺过程和干热病毒灭活过程前后PCC中凝血因子活性的变

18、化，结果显示PCC冻干工艺前后PCC中四种凝血因子活性无明显变化，而干热病毒灭活后PCC中四种凝血因子活性均有明显下降，因此在PCC半成品制备时要把工艺过程中凝血因子效价的损失考虑在内。PCC中的凝血因子的配比关系到制品的致血栓性，如FVD较高时可导致FVDa更多，被认为是导致引发血栓的一个重要原因。尤其FII和FX较高时，其致血栓性增强。有资料显示,PCC中四种凝血因子的比例为1：1：1：1时，其致血栓性应最低。因此，实验中分析了PCC干热病毒灭活后样品中四种凝血因子的比例,结果显示，三批PCC中四种凝血因子的比例基本一致,但是凝血因子vn效价较低，凝血因子n效价偏高，今后还有待进一步优化该

19、制备工艺,使四种凝血因子的比例趋于一致。参考文献1包正琦，何彦林.人凝血酶原复合物制备工艺研究现状门.微生物学免疫学进展,2013,41(4)：79-84.2 郑志华，菅K勇，张翠萍，等.人凝血酶原复合物临床应用研究进展J.临床血液学杂志,2014,27(4)：352-355.3 FranchiniM,LippiG.Prothrombincomplexconcentrates:anupdateJ.BloodTransfus,2010,8(3):149-154.4 国家药典委员会.中华人民共和国药典(三部)S.北京：中国医药科技出版社,2010：附录75-76.5 田倩,曹海军，曹雅，等.人凝血酶原复合物中凝血因子活性测定的影响因素研究J.中国生化药物杂志,2014,34(2):17-19.6 李青，刘晓，张璘，等.人凝血酶原复合物中凝血因子IX效价检测中影响因素的探讨J.中国输血杂志,2014,27(11)：1249-1251.7PeterH.Productionandcompositionofprothrombinco