体外循环致先天性心脏病手术患者血液细胞因子水平的变化

1、体外循环致先天性心脏病手术患者血液细胞因子水平的变化【摘要】目的探讨体外循环对先天性心脏病手术患者外周血细胞因子水平的影响。方法以先天性心脏病手术患者为研究对象，不需体外循环的心血管手术患者作为对照，酶联免疫吸附法和生物活性法测定手术前、中、后多时间点外周血中细胞因子水平。结果二组患者术中和或术后白细胞介素-2明显降低(P0.05)；可溶性白细胞介素-2受体、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-和白细胞介素-10明显升高(P0.05)。结论手术应激和体外循环均是引起先天性心脏病患者术中和或术后细胞因子水平改变的主要因素。【关键词】先天性心脏病体外循环细胞因子The Changes of Cytoki

2、nes Levels Related to Cardiopulmonary Bypass in Patients Undergoing Surgery for Congenital Heart Defects【Abstract】ObjectiveTo examine the effect of cardiopulmonary bypass(CPB) on cytokines levels of peripheral blood in patients undergoing surgery for congenital heart defects.MethodsThe possible diff

3、erences between patients undergoing surgery for congenital heart defects(CPB group, n=10) and those receiving closure of patent ductus arteriosus or pericardiectomy(no-CPB group, n=9) were evaluated. Venous blood levels of interleukin-2(IL-2),soluble interleukin-2 receptor(sIL-2R),interleukin-6(IL-6

4、),tumor necrosis factor-(TNF-), and interleukin-10(IL-10) were measured by means of biological activity assay or enzyme-linked immunosorbent assays at multiple time points before, during, and after operation.ResultsAs compaired with pre-operative values, IL-2 levels decreased significantly in both g

5、roups (P0.05), and the levels of sIL-2R, IL-6, TNF-, IL-10 increased significantly in both groups at multiple time points after operation(P0.01). Although there were no pre-operative differences in these cytokines between the two groups(P0.05), the post-operative changes of cytokines in CPB group wa

6、s more obvious than that in no-CPB group(P0.01). There also was a preceding IL-10 peak value, as compared with the peak values of IL-6 and TNF- in CPB group.ConclusionThe results suggest that besides surgical stress mediated cytokines respones, CPB itself also results in obvious changes of cytokines

7、 metabolism.【Key words】Congenital heart defectsCardiopulmonary bypassCytokines体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)心脏手术所致的全身炎症反应(systemic inflammatory response)和术后并发症的关系是值得关注的问题。全身炎症反应的发生和发展与多种细胞因子有关。为探讨CPB对先天性心脏病手术患者外周血细胞因子水平的影响，我们测定了CPB手术和非CPB心血管手术患者术前、术中和术后外周血细胞因子(cytokines)水平。1临床资料与方法患者临床资料(表1)。麻醉诱导

8、后气管插管、机械通气、静脉复合麻醉。 表1二组患者临床资料组别例数年龄(岁)心功能(NYHA)手术男女ASD修补VSD修补PDA结扎心包剥离CPB组3716.4 7.61973非CPB组4519.617.02763注：ASD：房间隔缺损；VSD：室间隔缺损；PDA：动脉导管未闭CPB组患者常规晶体液预冲，经升主动脉和右心房插管，鼓泡式氧合器及转动泵进行CPB；非CPB组患者经左胸或胸骨正中切口施行手术。无菌条件下抽取外周静脉血5ml，其中肝素抗凝血3ml、非抗凝血2ml。测定指标为：白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)、可溶性白细胞介素-2受体(soluble interle

9、uk-2 receptor, sIL-2R)、 白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子-(tumor necrosis factor-，TNF-)和白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)。抗凝血常规分离单个核细胞，用Hanks液洗涤2次，无血清RPMI-1640培养液洗涤1次，用5%小牛血清-RPMI-1640培养液调制成2106ml细胞悬液，取1ml于康氏管中加入植物血凝素(PHA，200gml)、37、5%CO2条件下培养48小时。取对数生长期，IL-2依赖性生长的TLL细胞株用5%小牛血清-RPMI-1640培养液调制成1105ml细胞

10、悬液，在96孔平底细胞培养板中加入CTLL细胞株悬液100l孔，培养上清液100l孔，每份样品作三复孔，同时作不同稀释度的重组人白细胞介素-2(rHIL-2)标准品和培养液对照，37、5%CO2条件下培养24小时。终止培养前6小时离心，去上清110l孔，加入噻唑篮(MTT)10l孔，37、3小时测OD570nm和OD630nm值，每孔OD值OD570nmOD630nm。 包被缓冲液稀释单抗至5gml，加入酶标板，每孔100l过夜；封闭液200l孔，37、2小时、洗涤2次；加样品稀释液100l孔、依次加入空白对照，用样品稀释液稀释标准品(白求恩医科大学免疫室)成1600uml，800uml，40

11、0uml，100uml及待测样品50l，每份作复孔、混匀、37、2小时、弃之、洗涤3次；各孔加入100l兔抗IL-2R-多克隆抗体血清(140)、37、2小时、洗涤3次，每次5分钟；各孔加入100l酶标驴抗兔抗体(114)、37、2小时、洗涤3次，每次5分钟；各孔加入100l邻苯二胺(OPD)底物溶液，室温避光反应10分钟，加入50l终止液(2M H2SO4)，即刻用酶标仪(华东电子管厂)测OD值490nm值；以sIL-2R单位为横座标，不同稀释度OD值为纵座标绘制标准曲线；用样品与空白对照的OD差值在曲线上查找sIL-2R含量。收集非抗凝血血清，20保存。将标本从冰箱中取出，平衡至室温，将板

12、条(已用抗-IL-6、IL-10、TNF-单抗预包被)取出，加入标准品(美国Genzyme公司)稀释液100l，加入样品和不同稀释度(IL-6和IL-10：2000pgml、1000pgml、500pgml、250pgml、125pgml、60.5pgml、30.25pgml、0pgml；TNF-：1200pgml、600pgml、300pgml、150pgml、75pgml、37.5pgml、0 pgml)标准品各100l至相应孔中，37、60分钟；加入生物素标记的二抗100l孔，37、60分钟；加入酶联物100l孔，37、20分钟；加入底物四甲基联苯胺(TMB)100l，避光37、15分钟

13、，加入终止液(2N H2SO4)1滴，在450nm处读数。标本采集时间为：(1)术前1天；(2)CPB转流前；(3)CPB停机后；(4)术后1天；(5)术后3天；(6)术后7天。非CPB组患者无第(2)时间点标本采集，而第(3)时间点标本在关胸后采集。资料使用“中国医学百科全书医学统计学”软件包(第2版)进行统计学分析，数据以s表示，采用析因试验的方差分析，被认为差异具有显著性意义(P0.05)。2结果二组患者细胞因子检测结果见表2。2.1IL-2表2二组患者细胞因子水平的变化检测时间IL-2(IUml)sIL-2R(Uml)IL-6(pgml)TNF-(pgml)IL-10(pgml)ABA

14、BABABAB术前19.44.419.64.5299.094.2322.090.212.56.411.94.719.08.922.38.567.119.464.820.1转流前14.25.3*-478.067.5*-38.07.5*-29.19.4*-179.145.0*-停机后术毕11.22.0*15.73.7*873.084.2*497.839.3*47.011.3*29.45.6*32.08.8*30.37.1545.173.6*129.643.6*术后1天13.52.2*13.83.2*592.0103.9*584.439.1*77.116.0*34.07.5*44.59.2*34.4

15、6.0*297.547.6*162.03.0*术后3天15.83.0*15.23.0*478.090.0*497.861.8*39.812.7*18.45.029.78.1*28.27.0170.943.4*115.822.0*术后7天18.63.317.44.5297.090.1356.763.616.35.19.63.520.57.921.18.757.813.565.818.6注：A为CPB组，B为非CPB组；*与术前比较P0.05；*与术前比较P0.01 二组患者术后IL-2水平均明显降低(P0.05)，术后第7天仍低于术前值，但无差异(P0.05)；二组患者术前IL-2水平无差异(P

16、0.05)，但CPB停机术毕，CPB组患者IL-2水平降低更为明显(P0.01)。2.2sIL-2R二组患者术后sIL-2R水平均明显升高(P0.01)，术后第7天均回复至术前水平；二组患者术前sIL-2R水平无差异(P0.05)，但CPB停机术毕，CPB组患者sIL-2R水平升高更为明显(P0.01)。2.3IL-6二组患者术后IL-6水平均明显升高(P0.01)，术后第7天CPB组患者IL-6值仍高于术前，但无差异(P0.05)；二组患者术前IL-6水平无差异(P0.05)，但在CPB停机术毕，术后1天，术后3天CPB组患者IL-6水平升高更为明显(P0.01)。2.4TNF-二组患者术后

17、TNF-水平均明显升高(P0.05)，但术后第7天均回复到术前水平；二组患者术前TNF-水平无差异(P0.05)，但术后第1天CPB组患者TNF-水平升高更为明显(P0.01)。2.5IL-10二组患者术后IL-10水平均明显升高(P0.01)，术后第7天回复到术前水平；二组患者术前IL-10水平无差异(P0.05)，但在CPB停机术毕，术后1天，术后3天CPB组患者IL-10水平升高更为明显(P0.01)。3讨论近年虽然CPB手术的安全性已有明显提高，但如何防止再灌注损伤的问题尚未解决1。CPB所致全身炎症反应过程中释放的多种细胞因子可激活内皮细胞，增加粘附分子表达，促使内皮细胞与活化中性粒

18、细胞之间粘附和作用，引起CPB心脏手术后多种并发症23。我们的结果显示：CPB和非CPB心脏手术均可引起患者术后IL-2明显降低，sIL-2R、IL-6、TNF-和IL-10明显升高。尽管术前这些细胞因子的水平在二组患者之间无差异，但术后CPB组患者细胞因子的变化更为明显。IL-2是参与机体免疫防御的重要细胞因子。IL-2促进T细胞成熟，增强自然杀伤细胞功能，加速免疫球蛋白分泌4。国内外文献均报道CPB心脏手术可损伤细胞介导的免疫反应，抑制IL-2释放57。这种损伤可能与患者术前心功能、CPB时间和输血有关56。Markewitz7提出：CPB对细胞免疫的损伤是由于前向免疫调节抑制和免疫反应下

19、调；前者表现在CD4T细胞和IL-2R效应T细胞减少，后者则为抑制性单核细胞增多和大量前列腺素E2的释放。我们的研究显示：CPB和非CPB心脏手术均可引起sIL-2R释放明显增加，仅在CPB停机术毕CPB组sIL-2R水平升高较非CPB组明显。sIL-2R可竞争性结合IL-2，从而形成一种免疫抑制复合物4。尽管CPB心脏手术sIL-2R升高的机理和临床意义仍不清楚，但显然IL-2减少和sIL-2R增加对患者免疫防御机能极为不利。近年国外文献报道促炎症细胞因子，如IL-6、TNF-对心脏收缩功能和中性粒细胞-心肌间粘附有直接影响3，812。IL-6除作为B细胞和肝细胞刺激因子外，亦与缺血再灌注损

20、伤所致的心功能损伤有关。活化中性粒细胞引起心肌损伤需心肌表面细胞间粘附分子-1 (intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)表达及通过ICAM-1-CD116CD18的介导。体外实验证实：低氧应激及继后的再氧合可导致心肌释放大量IL-6，IL-6可诱导ICAM-1合成89。临床研究亦发现：CPB心脏手术后IL-6水平明显升高3，1011。该情况在术前左心功能不全的患者更为明显，因此这些患者术后可能需更多的血管活性药物支持11。TNF-也是一种促炎症细胞因子，其可引起低血压和多器官损害。CPB心脏手术后TNF-是否升高报道不一1，1012。我们的研究显示：

21、CPB和非CPB心脏手术均引起患者外周血中TNF-水平升高。IL-10是一种抗炎症细胞因子。体外实验证实其可抑制IL-1、IL-6、IL-8、TNF-及自身的合成12。我们的结果显示：CPB心脏手术引起患者IL-10释放明显高于非CPB心脏手术患者；此外，IL-10释放的峰值水平亦超前于IL-6和TNF-升高的峰值水平。尽管这种抗炎症细胞因子释放峰值超前于促炎症细胞因子释放峰值的意义尚不清楚，但可能与细胞因子网络中细胞因子的相互调节有关。Seghaye12认为IL-10通过下调促炎症细胞因子的生成可能有利于CPB心脏手术患者。我们的结果说明外科手术应激和CPB均是引起先天性心脏病手术患者术后细

22、胞因子变化的主要因素。这些细胞因子释放改变的机理和临床意义尚需进一步研究。本课题由纽约中华医学基金会资助(CMB-9318)作者单位： 610041 成都，华西医科大学附属第一医院胸心外科(肖锡俊、杜晓东、李勇、王允、袁宏声)，基础医学院免疫教研室(章崇杰、赵宗蓉、张平)4参考文献1Sawa Y, Shimazaki Y, Kadoba K, et al. Attenuation of cardiopulmonary bypass-derived inflammatory reaction reduces myocardial reperfusion injury in cardiac ope

23、ration. J Thorac Cardiovasc Surg,1996，111(1)29.2Boyle EM, Pohlman TH, Johnson MC, et al. Endothelial cell injury in cardiovasc surgery: The systemic inflammatory response. Ann Thorac Surg, 1997,63(1)277.3Cremer J, Martin M, Redl H, et al. Systemic inflammatory response syndrome after cardiac operati

24、ons. Ann Thorac Surg,1996,61(6)1714.4金伯泉.细胞和分子免疫学.西安：世界书出版公司，1995.103106.5Hisatomi K, Isomura T, Kawara T, et al. Changes in lymphocyte subsets, mitogen responsiveness, and interleukine-2 production after cardiac operations. J Thorac Cardiovasc Surg,1989，98(2)580.6黄毅，蓝鸿钧，蔡俊坚，等.体外循环对瓣膜替换病人T淋巴细胞免疫功能的影响.中华胸心血管外科杂志，1996，12(3)143.7Markewitz A, Faisit E, Lang S, et al. Successful restoration of cell-mediated immune response after cardiopulmonary bypass by immunomodulation. J Thorac Cardiovasc Surg,1