先天性心脏病心肌活检组织中微小病毒感染的定位

1、    先天性心脏病心肌活检组织中 微小病毒感染的定位        【摘要】目的了解人微小病毒B19(Parvovirus B19)感染在先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)心脏组织中的定位。方法采用巢式聚合酶链反应(PCR)和组织原位杂交(ISH)技术，对37例CHD患者外周血及手术活检的心肌组织和28例非先天畸形心肌组织进行B19 DNA的检测。结果37例CHD组中B19 DNA在血清及心肌组织中阳性率分别为16.22%(6

2、/37)和18.92+%(7/37)，且血清学与心肌同时阳性占2例；28例对照组中心肌组织中B19 DNA均为阴性，两组心肌组织间B19 DNA检出率差异有显著性(P=0.0421)。ISH在CHD中检出B19 DNA阳性4例，阳性信号定位在心肌细胞核，对照组中均无阳性信号。结论B19病毒感染主要侵袭心肌细胞核，它可能参与核酸的表达而影响心脏的发育导致畸形。【主题词】心脏缺损，先在性；细小病毒B19，人；聚合酶链反应；原位杂交 The localization of parvovirus B19 in cardiac biopsy tissue of congenital heart dise

3、aseWANG XiaomingZHANG GuochengHAN Meiyu（ Department of Pediatrics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xian 710032, China）【Abstract】ObjectiveTo explore the relationship between parvovirus B19 infection and congenital heart disease (CHD), and distribution of parvovirus B19 gene in ca

4、rdiac tissue.MethodsWe conducted a case controls study invesigaing the presence of B19 gene in cardiac biopsy tissue of 37 cases of CHD, 8 cases of rheumatic heart disease(RHD) and 20 cases of non-CHD with nested polymerase chain reaction(Nested PCR) and in situ hybridization(ISH).ResultsAmong 37 CH

5、D patients, 6 were B19 DNA positive in cardiac tissue (18.92%), while in control group, including 8 RHD patients (autopsy specimens) and 20 non-CHD patients, the B19 gene were all negative, there was a significant difference of B19 gene presence between CHD group and control group (P=0.0421). ISH of

6、 B19 gene in cardiac tissue were positive in 4 CHD patients and all were negative in control group. The B19 gene were found locating in the nucleus of cardiac cell by ISH.ConclusionParvovirus B19 infection correlated with CHD.Since B19 gene was mainly found in the cardiac cell nucleus, maybe it infl

7、uenced the regulation of gene expression and affected the development of heart with the reuslt of CHD.【Key words】Congenital heart disease;Parvovirus B19,human;Polymerase chain reaction;In situ hybridization先天性心脏病(CHD)是儿科常见的疾病，严重危害儿童的健康及生命，病因迄今尚未确定，为探讨其病因与B19病毒感染的关系及组织定位，我们做了以下研究工作。1材料和方法1.1研究对象37例CH

8、D取材于西京医院心脏外科1996年9月至1997年9月部分CHD患者外周血及手术修补活检心脏组织，全部病例均系临床及手术所确诊的CHD。男21例，女16例，年龄最大24岁，最小1岁，平均年龄5.6岁；病种有室间隔缺损20例，房间隔缺损12例，动脉导管未闭1例，法乐氏四联症1例，法乐氏五联症1例，肺动脉狭窄1例，室间隔缺损并右室双出口1例。对照组中8例风湿性心脏病(RHD)系同期手术患者外周血及活检心肌组织；男3例，女5例；年龄最大46岁，最小24岁，平均年龄32.4岁；单纯二尖瓣狭窄2例，二尖瓣狭窄并关闭不全5例，二尖瓣狭窄并主动脉瓣狭窄1例。20例为非先天畸形死亡患者，年龄最大14岁，最小4

9、天，平均年龄3.2岁，病种有新生儿硬肿症7例，肺炎合并心衰12例，风湿性心脏病1例。1.2试剂含有B19病毒DNA的质粒来自沙特皇家医院研究中心(KFSH Research Center)，经提纯后含量为70g/L。Taq DNA聚合酶、4×dNTPs、10×PCR 缓冲液和琼脂糖系美国Promega公司产品，蛋白酶K系美国Merck公司产品，地高辛标记及原位杂交试剂盒系德国Boehringer Mannheim公司产品。1.3引物的设计和合成引物的设计参照文献1，由上海生物工程研究所合成。外引物：1S 5-CTTTAGGTATAGCCAACTGC-3，2905-2924；

10、2A 5-ACACTGAGTTTACTAGTGGC-3，4016-3997；扩增产物1112 bp。内引物：3S 5-CAAAAGCATGTGGAGTGAGG-3，3187-3206；4A 5-CCTTATAATGGTGCTCTGGG-3，3290-3271；扩增产物104 bp。1.4DNA提取将新鲜心肌组织剪碎研磨成浆(石蜡组织切成5 m薄片，脱蜡、脱脂)SDS及蛋白酶K裂解消化，酚、氯仿-异戊醇抽提，无水乙醇沉淀，TE液溶解，-20保存待检。1.5PCR反应方法同文献1，50 l反应体系中双蒸水36 l，10×PCR缓冲液5 l，10 mmol/L 4×dNTPs 1

11、 l,Taq酶1 l，外引物1S和2A各300 ng,模板5 l(阳性对照1 l，阴性对照以双蒸水作模板)，混合后用石蜡油30 l覆盖。PCR循环条件为：931 min,551 min,721 min,35个周期后72充分延伸10 min，取第1次产物5 l为模板，以内引物3S，4A代替外引物，同上述反应体系及条件进行第2次PCR循环。同批用本法作猫细小病毒、腺病毒3/7型、呼吸道合胞病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和EB病毒巢式PCR检测，均为阴性。取扩增产物10 l电泳，104 bp处出现黄色电泳带者为阳性。1.6原位杂交以外引物合成的PCR产物1 112 bp片段为模板，低熔点胶纯化回收，

12、按地高辛标记试剂盒说明，采用随机引物法标记探针。方法同文献2，石蜡切片经二甲苯脱蜡，逐级酒精脱水后，0.2 mol/L盐酸10 min,10 g/ml的蛋白酶K 27消化15 min。含0.2%甘氨酸的PBS孵育10 min，4%多聚甲醛室温固定10 min，逐级酒精脱水后，预杂交2 h，每片加10 l探针杂交液，98变性10 min，聚冷10 min后，于湿盒中42过夜。逐级2×SSC，1×SSC，缓冲液振洗，缓冲液30 min，AP-anti Dig 2 h37缓冲液30 min，缓冲液NBT-BCIP混合物暗处显色3 h，缓冲液中止，酒精脱水，二甲苯透明，封片观察。2

13、结果2.1B19 DNA的PCR检测结果见表1和1。CHD组中血清B19 DNA阳性6例，占总数的16.21%；心肌中B19 DNA阳性7例，占总数的18.92%；血清与心肌标本中B19 DNA均为阳性的有2例；对照组中RHD血清B19 DNA阳性1例，而RHD及尸解心肌标本中B19 DNA均阴性；经Epinfo (version 5.0)统计软包处理，Fisher's确切概率检验，在CHD与RHD血清中B19 DNA阳性比较差异无显著性(2=0.07，P=0.792)，心肌中B19 DNA阳性比较差异也无显著性(2=1.79，校正P=0.324)；而CHD与总对照组心肌组织比较差异有

14、显著性(2=5.94，校正P=0.0421)。CHD血清与心肌标本中B19 DNA阳性比较也无差异(2=0.09，P=0.7600)。2.2组织原位杂交及病理观察特异性B19 DNA 探针对心肌杂交呈阳性反应4例，均为PCR阳性标本，其中2例是强阳性信号，阳性信号集中在细胞核内，呈紫蓝色颗粒状或斑块状，较多集中在核膜下，部分集中于核的一侧，而血管内皮与间质细胞未见阳性信号，见2。CHD心脏切片常规HE染色，B19 DNA阳性者未发现有明显心肌炎症及肌萎缩改变。表1B19 DNA的PCR检测结果Tab.1Detection of B19 DNA by PCR组别Groups心肌Cardiac s

15、pecimen血清Serum specimen阳性Positive阴性Negative阳性Positive阴性Negative先天性心脏病CHD patients730631风湿性心脏病RHD patients0817非先天畸形Non-CHD autopsies020-     1PCR检测B19 DNA产物结果Fig.1PCR product of B19 DNA1pGEM-3ZF-Hae marker. 2-8:Samples detected表2心肌阳性B19 DNA与CHD病种的关系Tab.2Distribution of B19 DNA pos

16、itivity in cardiac tissue of dlleceut CHD dcieares序号No.病种DiseasePCR-B19阳性PCR-B19 positive原位杂交ISH心肌Cardiac tissue血清Serum1VSD+2VSD+-+3VSD+-+4ASD+-+5VSD+-6ASD+-7ASD+-     VSD=室间隔缺损；ASD=房间隔缺损VSD=ventricular septal defectASD=atrial septal defect     2地高辛标记的B19 DNA探

17、针的心肌原位杂交(×400)Fig.2In situ hybridization of the cardiac tissue with DIG-labelled B19 DNA probe(×400)3讨论自Cossart发现人类微小病毒B19以来3，有关B19病毒致人类的疾病谱在不断扩大，现已证明B19病毒可引起传染性红斑、急性再生障碍性贫血、关节炎等人类多种疾病4，B19病毒感染是常见的母婴传播性疾病，在孕龄妇女中的感染率高达50%以上，而母胎垂直传播率达33%5，宫内胎儿B19病毒的感染可导致胎儿水肿、流产、死胎、先天性扩张型心肌病6及先天畸形7等，但B19感染与先天

18、性心脏病(CHD)的关系目前国内外尚未见报道。我们用巢式PCR技术及组织原位杂交技术进行B19病毒基因的检测及组织细胞的定位，其结果表明，CHD活检心肌中B19病毒感染率达18.92%，明显高于非先天畸形的心肌标本(均阴性)，经Fisher's确切概率检验提示二者差异有显著性(P=0.0421)，此结果与作者已报道的不同时期的CHD心肌石蜡标本中B19感染的结果相一致8，更进一步证明B19病毒感染和CHD有密切的相关性。CHD血清中B19的检出(占16.22%)，提示病毒系新近的感染，其感染率和国内报道新生儿及孕妇感染较一致9，而临床上无症状性感染更加说明其感染的潜在危险、或尚未被证实

19、的致病作用。CHD患者血清与心肌中B19DNA的低符合率为2/7，从另一方面反映了心肌组织中病毒基因的存在是既往感染的标志。心肌组织的原位杂交共检出4例阳性标本(占10.81%)与PCR结果一致，并发现阳性信号主要集中于心肌细胞核。B19病毒感染侵袭的靶部分为心肌细胞核，病毒基因是整合到核内，随着细胞核酸的复制而持续存在，在CHD心脏畸形发育中病毒基因是否是直接激活宿主细胞致畸基因，还是相加作用致致畸信息的表达有待进一步深入研究。本研究属国家计生委资助课题(9736)作者单位：王晓明（西安，第四军医大学西京医院老年病科710032）张国成（儿科）韩美玉（儿科）参考文献1，Musiani M,A

20、zzi A, Zerbini M, et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of B19 parvovirus DNA in human immunodeficiency virus patients. J Med Virol, 1993,40: 157-160.2，Walters C, Powe DG, Padfield CJ, et al. Detection of parvovirus B19 in macerated fetal tissue using in situ hybridization. J Clin Pathol, 1997, 50: 74