体外构建3D人工皮肤

1、www.CRTER.org刘钰，等. 体外构建3D人工皮肤体外构建3D人工皮肤刘 钰，沈 冲，孟 琴(浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江省杭州市 310027)引用本文：刘钰，沈冲，孟琴. 体外构建3D人工皮肤J.中国组织工程研究，2016，20(46):6915-6921.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.46.010 ORCID: 0000-0002-4320-9221(刘钰)文章快速阅读：3D人工皮肤的体外构建刘钰，女，1991年生，江西省丰城市人，汉族，硕士，主要从事组织工程研究。通讯作者：孟琴，教授，浙江大学化工系联合反应所，浙江省杭州市3100

2、27中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)46-06915-07稿件接受：2016-09-03结果表明，将角质细胞接种于牛尾胶原包埋的成纤维细胞上，可构建更好的人工皮肤将角质细胞接种于含鼠尾(或牛尾)胶原包埋的成纤维细胞上培养7 d，再气提培养7 d，获得人工皮肤从儿童包皮组织中分离培养原代成纤维细胞和角质细胞从牛尾和鼠尾中分别提取与纯化胶原牛尾(或鼠尾)胶原包埋成纤维细胞，构建真皮层文题释义：角质细胞培养方法：目前有2种方法，一种用特定的无血清培养基，如M199、F12MCDB153、KSFM、KGM，优点是无需饲养层细胞、培养方法简便易行；一种用鼠成纤维

3、细胞系(NIH3T3)或者鼠胚胎成纤维细胞作饲养层，角质细胞铺在丝裂霉素C处理过的成纤维细胞饲养层上，优点是培养基含血清和高钙，细胞生长快传代方便，缺点是细胞更容易分化，传代次数低于3次。体外构建人工皮肤：最初用饲养层来构建二维共培养模型，缺点是形成的皮肤寿命短，不能形成几层有序的角质层。其次将角质细胞种植于胶原包埋的成纤维细胞上，浸没培养7 d，随后气提培养获得人工皮肤，这一方法存在皮肤构建过程中胶原降解、胶原易收缩的缺点。目前已有研究采用3D 打印人工皮肤，不过存在成本高、成功率不高、皮肤表皮层不能分化为多层等缺陷。摘要背景：已有研究采用3D打印人工皮肤，但存在皮肤表皮层不能分化为多层等缺

4、陷。目的：优化人工皮肤的构建方法，获得更好的人工皮肤。方法：从牛尾和鼠尾中分别提取与纯化胶原。从儿童包皮组织中分离培养原代成纤维细胞和角质细胞，再以牛尾(或鼠尾)胶原包埋成纤维细胞，构建真皮层；将角质细胞接种于含鼠尾(或牛尾)胶原包埋的成纤维细胞上培养 7 d，再气提培养7 d，获得人工皮肤。观察人工皮肤的收缩性、水接触角，并进行苏木精-伊红染色、天狼猩红染色及免疫荧光染色。结果与结论：鼠尾胶原构建人工皮肤真皮层面积下降了50%，牛尾胶原构建人工皮肤真皮层面积只下降了21%；牛尾胶原构建人工皮肤的接触角与人皮肤接近，比鼠尾胶原构建人工皮肤的疏水性更好；天狼猩红染色结果显示，与鼠尾胶原构建的人工

5、皮肤相比，牛尾胶原构建人工皮肤的胶原折光性更强，胶原排列更有序，纤维更粗；苏木精-伊红染色显示，与鼠尾胶原构建人工皮肤相比，牛尾胶原构建人工皮肤真皮层的表皮可形成更多层；结果表明，将角质细胞接种于牛尾胶原包埋的成纤维细胞上，可构建更好的人工皮肤。关键词：组织构建；组织工程；人工皮肤；角质细胞；成纤维细胞；胶原；细胞角蛋白14；饲养层；表皮；国家自然科学基金主题词：皮肤，人工；成纤维细胞；胶原；组织工程基金资助：国家自然科学基金(21476197)3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Artificial skin preparation using

6、three-dimensional printing in vitro Liu Yu, Shen Chong, Meng Qin (School of Chemical Engineering and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China)AbstractBACKGROUND: Epidermis is unable to differentiate into stratum corneum and other parts in the previous ar

7、tificial skin constructed using three-dimensional printing.OBJECTIVE: To optimize the method of artificial skin construction to obtain more feasible artificial skin. METHODS: Type I collagen extracted from rat-tail and bovine tail was purified. Primary dermal fibroblasts and keratinocytes were isola

8、ted from childrens foreskin, and then embedded in bovine or rat tail collage to construct the dermis; keratinocytes were seeded on the dermis for 7 days, followed by 7-day air liquid interface, and the artificial skin was finally achieved. The contraction and hydrophobicity by water contact angle we

9、re detected, as well as the morphology was observed by hematoxylin-eosin staining, sirius red staining and immunofluorescence analysis.RESULTS AND CONCLUSION: Seven days after fibroblasts embedded in collagen, the area of bovine collagen was reduced by 21%, while that of rat tail collagen decreased

10、about a half. The water contact angle of the skin constructed by bovine tail collagen was similar to that of human skin, which was much higher than that of the skin constructed by rat tail collagen. Sirius red staining found that the skin constructed by bovine tail collagen had stronger refractivity

11、, more intact structure and thicker fibers than those of the skin constructed by rat tail collagen. Moreover, more multilayer keratinocytes appeared in the skin constructed by bovine tail collagen through hematoxylin-eosin staining. In conclusion, bovine tail collagen is more available for the artif

12、icial skin construction.Subject headings: Skin, Artificial; Fibroblasts; Collagen; Tissue EngineeringFunding: the National Natural Science Foundation of China, No. 21476197Cite this article: Liu Y, Shen C, Meng Q. Artificial skin preparation using three-dimensional printing in vitro. Zhongguo Zuzhi

13、Gongcheng Yanjiu. 2016;20(46):6915-6921.Liu Yu, Master, School of Chemical Engineering and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, Zhejiang Province, ChinaCorresponding author: Meng Qin, Professor, School of Chemical Engineering and Biological Engineering, Zhejiang University,

14、Hangzhou 310027, Zhejiang Province, China6921ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction皮肤是人体最大的器官，也是体内和外界的屏障，它包含表皮层和真皮层2部分1，其中表皮包括基质层、棘层、肉芽层、角质层；目前烧伤、外科手术皮肤缺损，慢愈性皮肤病急需新的皮肤替代物，而且皮肤替代物在皮肤病的药物研究中发挥重要作用，由于人体真实皮肤模型不可行，动物模型不能针对性代表药物对人体皮肤的作用，体外构建优良的人工皮肤具有重大意义。目前，文献已构建了一系列的皮肤替代物体外模型。最初用饲养层来构

15、建二维共培养模型，缺点是形成的皮肤寿命短，不能形成几层有序的角质层细胞2-3。其次将角质细胞种植于胶原包埋的成纤维细胞上，浸没培养7 d，随后气提培养获得人工皮肤，这一方法存在皮肤构建过程中胶原降解、胶原易收缩的缺点。目前已有研究采用3D打印人工皮肤，不过存在成本高、成功率不高、皮肤表皮层不能分化为多层等缺陷4-5。实验拟将原代角质细胞接种于包埋有成纤维细胞的胶原基质层，待角质细胞扩增成多层进行气提培养，构建人工皮肤6；分别采用牛尾胶原和鼠尾胶原包埋成纤维细胞，构建真皮层，再将角质细胞接种其上，待角质细胞扩增成多层后气提培养7 d，比较两种皮肤的收缩性、胶原束组成及组织形态。此人工皮肤不仅可用

16、于烧伤患者的皮肤移植，还可以作为新药评价体外模型，充实了人工皮肤的构建新方法。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 设计 3D人工皮肤的体外构建。1.2 时间及地点 实验于2014年10月至2016年3月在浙江大学化学工程与生物工程学院联合反应所完成。1.3 材料 经伦理委员会和供者家属同意，自浙江大学儿童附属医院门诊手术室获取1例年龄小于10岁患儿的包皮皮肤，大小约长5 cm×宽1 cm。3D人工皮肤体外构建实验的主要试剂：试剂来源Dispase中性蛋白酶Roche型胶原酶、DMEM粉末、F12粉末、霍乱毒素、三碘甲状腺原氨酸、胰岛素、乙醇胺、磷酸乙醇

17、胺、转铁蛋白Sigma无钙DMEM粉末上海卡迈舒生物科技公司氢化可的松、腺嘌呤、胰蛋白酶、孕酮上海生物工程有限公司胎牛血清gibco人表皮生长因子peprotech丝裂霉素CmerckCK1、Collagen 武汉博士德生物科技公司CK14、P63、IgG-FITC Invitrogen1.4 实验方法 人包皮成纤维细胞及角质细胞的分离：将新鲜的环切包皮放置在PBS中，在超净工作台去除皮下脂肪，经含500 U/mL青链霉素双抗的PBS漂洗3次，去除残余的血液与脂肪，以眼科剪将皮肤块剪成5 mm2大小的皮片，在含2.5 U/mL中性蛋白酶的HBSS中4 过夜，消化18 h；次日用镊子揭去表皮层，

18、将表皮层放置在含有少许PBS的培养皿中，用于分离角质细胞，剩下的真皮组织用PBS清洗2次，洗去残余的角质细胞，真皮层用于分离成纤维细胞，方法参考文献7。人包皮成纤维细胞与角质细胞的原代培养与传代培养：将真皮剪碎，用10 mL 0.1% 型胶原酶振荡消化1.0-2.0 h，消化液用200目滤网过滤，离心得到的细胞沉淀重悬，计数，在含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中培养，待细胞长至90%融合时用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA进行13传代。将得到的表皮用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化15 min，在含体积分数10%胎牛血清的角质培养基中终止消化，用200目的滤网过滤，

19、离心重悬，将细胞接种在预铺有饲养层的培养皿，角质细胞培养基用经典的改良的Greens的培养基8，即31 DMEM/F12、含体积分数10%胎牛血清、氢化可的松0.4 mg/L、人表皮生长因子 10 µg/L、霍乱毒素10-10 mol/L、胰岛素5 mg/L、青链霉素100 U/mL，角质细胞培养在丝裂霉素C处理的原代成纤维细胞饲养层上；角质细胞在饲养层上长成克隆，约长至80%融合，用0.02%EDTA作用20 s，接着0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA孵育15 s，去除饲养层后，追加0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA继续消化，不超过 15 min，传代细胞培养在预铺有饲养层

20、的培养瓶中，具体方法参考文献9。饲养层的准备：待人皮肤成纤维细胞融合，用含10 mg/L丝裂霉素C的培养基在37 培养2 h，消化重新接种至50%融合，饲养层贴壁后半融合对角质细胞的克隆生长最优9。角质细胞的鉴定：将角质细胞以2×108 L-1的细胞浓度接种入24孔板，待细胞长至约80%融合时，将细胞孔用PBS洗3遍，40 g/L多聚甲醛4 固定过夜，PBS清洗3×2 min，用0.5%曲拉通孵育30 min，用PBS清洗3次× 2 min，再用含5%BSA的PBS封闭1 h，然后分别滴细胞角蛋白14(11 000)和角质细胞核蛋白p63(11 000)，4 过夜

21、，次日用PBS清洗3×5 min，加入带有荧光标记的二抗，放在室温孵育1 h，然后用PBS清洗3×5 min，接着DAPI避光染色细胞核5 min，然后用PBS洗3次，荧光显微镜下观察并照相10-12。胶原提取与纯化：型鼠尾胶原提取经Rajan等13报道的方法改进获得：从鼠尾中提取胶原丝并剪碎，用1%乙酸溶解3 d，离心除去未溶解部分，溶解部分经等体积10%NaCl盐析，5 000 r/min离心获得粗提胶原凝胶，再将获得的胶原重新溶解在0.1%乙酸中，可获得纯度较高的胶原溶液；牛尾胶原提取参考文献14-15报道的方法：从牛尾中提取牛尾胶原丝，剪碎，用1%乙酸和含0.2%胃

22、蛋白酶混合液溶解浸泡胶原3 d，离心除去未溶解部分，溶解部分经等体积10%NaCl盐析 5 000 r/min离心获得粗提胶原凝胶，再将获得的胶原重新溶解在0.1%乙酸中，可获得纯度较高的胶原溶液，纯化用SDS-PAGE电泳分析纯度16。3D人工皮肤的构建：将角质细胞种植在胶原包埋成纤维细胞收缩而成的真皮层上，待角质长至多层，气提培养7 d，分化成含基质层、棘层、肉芽层，角质层的人工皮肤，方法参考文献8。首先构建真皮层，在每个浅孔transwell孔先铺一层非细胞胶原层，待成纤维细胞融合后胰酶消化，以终浓度2×109 L-1加至胶原溶液中，按表1顺序依次加，将混合物在冰上混合均匀，取

23、3 mL加至浅孔transwell中的内孔，培养箱孵育30 min；胶原凝固后，将2 mL培养基加至浅孔transwell中的内孔，3 mL加至外面的孔，在培养基中培养7 d左右，胶原和细胞一起收缩成稳定大小的真皮层，第8天，成纤维细胞胶原层收缩完全，角质细胞加至真皮层的中央，加50 µL浓度1×1010 L-1的原代角质细胞至真皮层的中心，不加任何培养基，在培养箱中2 h，待角质贴壁后，第9-11天2 mL EPi培养基加至transwell的内孔，3mL加至外孔。第12-15天，将2 mL EPi培养基加至浅孔transwell的内孔，3 mL加至孔中，第15-21天，

24、气提培养，将10 mL角质培养基加至深孔transwell的外孔，第21天收获皮肤。培养基成分与文献8相同。表1 两种胶原层的各成分Table 1 Components of the two kinds of collagens成分非细胞胶原层(每孔1 mL)细胞胶原基质层(每孔3 mL)10×DMEM0.59 mL1.65 mL谷氨酰胺0.05 mL0.15 mLFBS0.6 mL1.8 mL5 mol/L NaOH0.02 mL0.06 mL3 g/mL胶原4.6 mL14 mL人原代成纤维细胞-1 mL(细胞浓度2×109 L-1)总体积6 mL18 mL1.5 主要

25、观察指标苏木精-伊红染色：气提培养完成，取出皮肤，40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS清洗1遍，经体积分数50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、100%、100%乙醇脱水，体积分数50%乙醇-二甲苯、纯二甲苯、纯二甲苯透明、过夜浸泡在石蜡中，第2天石蜡包埋，切 8 m薄片，苏木精-伊红染色，用干性树胶封固，显微镜下观察皮肤形态。免疫荧光染色：石蜡切片同苏木精-伊红染色中切片步骤，切片脱蜡至水，抗原修复，体积分数5%山羊血清封闭，孵育10 min，加适当比例稀释的一抗(角蛋白CK1、CK14、型胶原蛋白)，4 过夜，PBS洗3次，每次5 min，加适当比例的二抗(避光)

26、，DAPI染核，免疫荧光显微镜下观察。天狼猩红染色：切片经脱蜡，入水，直接泡在天狼猩红染料1 h，纯乙醇洗2次，二甲苯中10 min，封固，在偏振显微镜中观察，可以看出胶原的类型及含量17。接触角测量：将表面平整的人工皮肤在接触角测量仪上进行接触角测试，将3 L去离子水垂直滴在皮肤压片上，在液滴接触皮肤表面后第0，10秒采集图片样本，切线法读出接触角18。2 结果 Results 2.1 成纤维细胞和角质细胞的分离 新鲜分离的原代成纤维细胞贴壁后6 d之内可以长融合，呈明显的旋涡状纤维细胞样生长，见图1A；角质细胞需要9-14 d才能长至融合，形态呈铺路石状，见图1B。图1 儿童包皮分离的成纤

27、维细胞和角质细胞形态(×100)Figure 1 Morphology of fibroblasts and keratinocytes isolated from childrens foreskin (×100)图注：图中A为成纤维细胞，旋涡状形态生长；B为角质细胞，呈铺路石形态生长。2.2 角质细胞鉴定结果 P63是一个角质细胞特有的转录核因子，在表皮形成过程扮演双重的角色，其不仅作为角质细胞角质化形成上皮的开关，也维持基质层角质细胞的增殖能力，P63的表达最初在表皮的基质层发现19，CK14是基质层细胞(具备活跃增殖能力的角质细胞)表达的角蛋白。基质层角质细胞特异性

28、表达角蛋白CK14和P6320-21，免疫荧光鉴定结果表示细胞角蛋白CK14与P63阳性，从而鉴定出该细胞为基质层角质细胞，其具有活跃增殖能力，见图2。图2 角质细胞的免疫荧光鉴定结果(×100)Figure 2 Identification of keratinocytes (immunofluorescence staining, x100)图注：图中A显示，细胞含有角质特异性角蛋白K14角蛋白；B显示，细胞含有角质特异性角蛋白P63角蛋白(×100)。2.3 牛尾胶原和鼠尾胶原包埋成纤维细胞的皮肤收缩性比较 牛尾与鼠尾胶原包埋成纤维细胞做基质层构建皮肤，两者收缩有明显

29、差异，气体培养7 d后，鼠尾胶原构建人工皮肤大小收缩至原来面积的一半，牛尾胶原构建人工皮肤仅缩小了原来面积的21%，见图3。图3 牛尾与鼠尾胶原构建人工皮肤的收缩性比较Figure 3 Comparison of the contraction of artificial skin established bovine tail collagen or rat tail collagen120100806040200皮肤面积(%)0 10 20 30时间(d)牛尾胶原构建人工皮肤鼠尾胶原构建人工皮肤鼠尾 牛尾 2.4 牛尾与鼠尾胶原构建人工皮肤接触角的比较 将表面平整的人工皮肤在接触角测量仪上

30、进行接触角测试，发现牛尾胶原构建人工皮肤的接触角与猪皮和人皮肤接近，而鼠尾胶原构建人工皮肤水接触角很小，见表2。表2 不同来源皮肤的接触角Table 2 The contact angle of skins from different samples样品皮肤来源接触角猪皮腹部41.5°成人皮肤样品(浙江大学儿童附属医院提供)手指78.5°手臂75°人工皮肤牛尾胶原构建人工皮肤49°鼠尾胶原构建人工皮肤< 10°2.5 3D人工皮肤的组织形态学观察苏木精-伊红染色结果：可见完整的真皮层与完整的表皮层，在牛尾胶原基质上的角质细胞长成更多层，

31、可见角质细胞在牛尾胶原基质上生长更好，见图4。天狼猩红染色结果：牛尾胶原构建人工皮肤真皮层的胶原折光性更强，胶原排列更有序，纤维更粗；鼠尾胶原构建人工皮肤真皮层胶原折光性偏弱，胶原排列疏松，纤维更细，推测其与两者在收缩性上的差异有关，见图5。图4 不同胶原构建人工皮肤的苏木精-伊红染色结果(×100)Figure 4 Hematoxylin-eosin staining of the artificial skin constructed with different collagens (×100)图注：图中A为牛尾胶原构建人工皮肤，可见含基质层、棘层、肉芽层、角化层的完

32、整表皮；B为鼠尾胶原构建人工皮肤，表皮层只有2层，基质层和角化层。图5 不同胶原构建人工皮肤的石蜡切片天狼猩红染色结果(×50)Figure 5 Paraffin sections of the artificial skin constructed with different collagens (sirius red staining, ×50)图注：图中A为牛尾胶原构建人工皮肤，型胶原排列紧密，纤维粗；B为鼠尾胶原构建人工皮肤，胶原排列疏松，纤维细。2.6 3D人工皮肤组织的免疫荧光染色观察 将牛尾胶原构建人工皮肤组织进行角蛋白CK14、CK1、型胶原免疫荧光学染色

33、，其中CK14可表征皮肤的基质层，CK1可显示上面的肉芽层和角化层，型胶原可现实真皮层与表皮层的连接部位基层，见图6。图6 牛尾胶原构建人工皮肤的免疫荧光染色(×100)Figure 6 Immunofluorescence staining of the artificial skin constructed by bovine tail collagen (×100)图注：图中A为角质细胞角蛋白CK14阳性表达，位于表皮基质层；B为角质细胞角蛋白CK1阳性表达，位于表皮的棘层与肉芽层；C为型胶原阳性表达，位于表皮与真皮结合处。3 讨论 Discussion能否构建完整的

34、分化多层的皮肤，成纤维细胞和角质细胞的增殖能力至关重要。不少文献在分离表皮与真皮用胰酶消化，处理效果并不好22。实验分别用胰酶和中性蛋白酶消化皮肤块，结果发现中性蛋白酶处理过的皮肤表皮与真皮很容易分开，比胰酶处理的效果好(数据未在结果中显示)。这是因为中性蛋白酶只破坏真皮与表皮分界层的半桥粒，不会分解细胞与细胞间的桥粒，可将完整的表皮从真皮剥离，分离得到的原代角质细胞和成纤维细胞都很少混杂其他细胞，细胞活率更强，生长也更好。角质细胞培养目前有2种方法，一种用特定的无血清培养基23，如M199，F12，MCDB15324、KSFM25、KGM26，优点是无需饲养层细胞、培养方法简便易行；一种用鼠

35、成纤维细胞系(NIH3T3)或者鼠胚胎成纤维细胞作饲养层，角质细胞铺在丝裂霉素C处理过的饲养层上7，优点是培养基含血清而且高钙，细胞生长快传代方便，缺点是细胞更容易分化，传代次数低于3次。鉴于无血清培养基价格昂贵，实验采用经典的饲养层培养法，用原代成纤维细胞作为饲养层，扩增角质，而不是用常用的3T3或鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层。另外有研究比较不同饲养层接种密度的角质克隆情况，结果证明了角质细胞与饲养层11接种，角质细胞生长速度与克隆大小最理想9。实验验证了饲养层的密度对于角质细胞增殖的影响，发现以1×108 L-1最佳，即饲养层贴壁后半融合状态，饲养层与角质细胞11接种培养最利于角质

36、细胞的克隆生长。Lam等27发现用异体成纤维作饲养层和自体成纤维细胞作饲养层可获得一样的好效果，但是Rheinwald等28发现3T3饲养层细胞比人成纤维细胞更有助于人角质细胞的生长，然而也有报道结论相反。有研究发现角质生长在原代皮肤成纤维细胞饲养层上比在NIH3T3饲养层上生长状态更好，克隆更大，支持了部分文献的结论29。型胶原是一种天然的生物可降解材料，虽然胶原的理化性质较差，存在力学强度低、易收缩、易降解等缺点30，但具有良好的生物学性能，被广泛用于组织工程支架、基质材料31，已在临床多个领域得到应用，如可吸收缝合线、人工皮肤。胶原由、链组成的单聚体和二聚体组成32，在透射电镜下，胶原由

37、相互交织的胶原原纤维组成，有规则的横纹存在33，鼠尾型胶原的纤维丝直径280 m，牛型胶原和鼠尾型胶原在透射电镜下结构类似，牛尾胶原纤维丝的直径和鼠尾胶原略有不同，在5-15 nm范围差异不等34。人工皮肤的真皮层往往收缩很严重，甚至收缩至原来面积20%35。其收缩受多种因素影响36，如细胞密度、胶原浓度、血清等，有研究用不降解支架和成纤维细胞、角质细胞共培养构建3D人工皮肤37，但是基于胶原可以通过调节pH温度自行凝固而不需添加交联剂的优点，胶原包埋成纤维细胞作为真皮层应用广泛。实验发现与鼠尾胶原相比，牛尾胶原收缩会明显降低，角质细胞分别接种在这2种真皮层，牛尾胶原、成纤维细胞、角质细胞构建

38、的皮肤更大，可更好解决皮肤移植时皮肤量不足的问题，牛尾胶原构建的皮肤收缩性比鼠尾胶原小，猜测这与胶原性质有关，如胶原纤维粗细、胶原凝胶支架的孔隙。细胞在这两种胶原基质中的生长能力也会影响胶原的收缩，文献15发现两种胶原支架的孔隙相差不大，均由、链组成，人牙龈成纤维细胞在鼠尾胶原支架上的生长增殖能力优于牛尾胶原支架，这可能导致牛尾胶原支架收缩显著下降。通过苏木精-伊红染色观察构建的人工皮肤，可在显微镜中看到包含完整真皮与表皮层的皮肤，上层是表皮层，下层是真皮层，表皮层比真皮层薄，与文献38报道的结果基本一致，牛尾型胶原构建真皮层的表皮可形成更多层。免疫荧光染色分析构建的人工皮肤，结果与文献38-

39、40基本一致。天狼猩红染料与胶原分子结合，长轴平行，可在偏振纤维镜下加强双折射，且与不同类型胶原结合，颜色会不一，可特异性的表征胶原类型，定位胶原及胶原粗细，被广泛用于组织中胶原形态观察及组织纤维化、组织病变形态观察17，41，天狼猩红染色比马松三色染色效果更好。天狼猩红染色结果显示，与鼠尾胶原构建的皮肤相比，牛尾型胶原构建的皮肤真皮层胶原折光性更强，胶原排列更有序，纤维更粗，由此推测这和角质细胞的增殖分化相关，牛尾胶原基质更有利于角质的增殖分化，从而长成更多层皮肤。实验构建的人工皮肤包含成纤维细胞和角质细胞，可用于临床移植皮肤，也可用于皮肤病的治疗，人工皮肤替代物可加快慢性愈合如糖尿病足廯的

40、治疗，但由于缺少血管内皮细胞，造成伤口血管新生延迟，不利于伤口处的皮肤再生。因此可构建出含成纤维细胞、血管内皮细胞、角质细胞的人工皮肤，将成纤维细胞与血管内皮细胞包埋在牛胶原，构建真皮层，角质接种在真皮层，最终气提培养得到完整的人工皮肤。结论：用丝裂霉素C处理的原代成纤维细胞作为饲养层比NIH3T3饲养层更有利于角质细胞的生长，而且饲养层的接种细胞浓度为1×108 L-1时，原代角质细胞的生长及克隆效率最优，且比无血清条件下的原代角质细胞生长快，成本低；实验分别采用牛尾型胶原和鼠尾型胶原构建3D人工皮肤，发现牛尾胶原构建的皮肤收缩性更小，皮肤组织形态疏水性均和人体皮肤接近，从而可获得

41、更好的皮肤，降低皮肤生产的成本。作者贡献：通讯作者进行实验设计，第一作者实施评估，结果分析，成文，审校。利益冲突：所有作者共同认可文章内容不涉及相关利益冲突。伦理问题：皮肤供者家属对实验知情同意。文章查重：文章出版前已经过CNKI反剽窃文献检测系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲外审，符合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁，可接受核查。文章版权：文章出版前杂志已与全体作者授权人签署了版权相关协议。4 参考文献 References1 Bouwstr

42、a JA,Honeywell-Nguyen PL.Skin structure and mode of action of vesicles.Adv Drug Deliv Rev.2002;54 Suppl 1:S41-55.2 Green H,Kehinde O,Thomas J.Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979;76(11): 5665-5668.3 Bell E,Ivarsson B,M

43、errill C.Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(3):1274-1278.4 Lee V,Singh G,Trasatti JP,et al.Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting

44、.Tissue Eng Part C Methods.2014;20(6):473-484.5 Koch L,Deiwick A,Schlie S,et al.Skin tissue generation by laser cell printing.Biotechnol Bioeng.2012;109(7): 1855-1863.6 Bell E, Ehrlich HP, Buttle DJ,et al.living tissue formed in vitro and accepted as a full thickness skin equivalent. Science.1981;21

45、1(4486):1052-1054.7 Aasen T,Izpisúa Belmonte JC.Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.Nat Protoc. 2010;5(2):371-382.8 Carlson MW,Alt-Holland A,Egles C,et al.Three- Dimensional Tissue Models of Normal and D

46、iseased Skin.Curr Protoc Cell Biol.2008;Chapter 19:Unit 19.9.9 Dragúová J,Kabát P,Koller J,et al.Experience gained during the long term cultivation of keratinocytes for treatment of burns patients.Cell Tissue Bank. 2012; 13(3):471-478. 10 Woodcock-Mitchell J,Eichner R,Nelson WG,et al.

47、Immunolocalization of keratin polypeptides in human epidermis using monoclonal antibodies.J Cell Biol. 1982; 95(2 Pt 1):580-588.11 Papini S,Cecchetti D,Campani D,et al.Isolation and Clonal Analysis of Human Epidermal Keratinocyte Stem Cells in Long-Term Culture.StemCells.2003; 21(4):481-494.12 Lane

48、EB.Monoclonal antibodies provide specific intramolecular markers for the study of epithelial tonofilament organization.J Cell Biol.1982;92(3):665-673.13 Rajan N,Habermehl J,Coté MF,et al.Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engi

49、neering applications. Nat Protoc.2006;1(6):2753-2758.14 Tamilmozhi S,Veeruraj A,Arumugam M.Isolation and characterization of acid and pepsin-solubilized collagen from the skin of sailfish (Istiophorus platypterus). Food Res Int.2013;54:1499-1505.15 Techatanawat S.Type I collagen extracted from rat-t

50、ail and bovine Achilles tendon for dental application: a comparative study.Asian Biomed.2011;5:787.16 Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature. 1970;227(5259):680-685.17 Junqueira L,Cossermelli W,Brentani R.Differential staining of collage

51、ns type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy.Arch Histol Jpn. 1978;41(3):267-274.18 王雪,金剑,肖长发.疏水改性聚对苯二甲酸乙二醇酯的合成与表征J.纺织学报,2011,32(4):12-17.19 Koster MI,Roop DR.The role of p63 in development and differentiation of the epidermis: Tanioku kihei memorial lecture.J Dermatol Sci.2004;34

52、(1):3-9.20 Nelson WG,Sun TT.The 50-and 58-kdalton keratin classes as molecular markers for stratified squamous epithelia: cell culture studies.J Cell Biol.1983;97(1):244-251.21 Yang A,Kaghad M,Wang Y,et al.p63, a p53 homolog at 3q2729, encodes multiple products with transactivating, death-inducing,

53、and dominant-negative activities.Mol Cell. 1998;2(3):305-316.22 Liu SC,Karasek M.Isolation and growth of adult human epidermal keratinocytes in cell culture.J Invest Dermatol.1989;92(4 Suppl):164S;discussion 165S.23 Tenchini M,Ranzati C,Malcovati M.Culture techniques for human keratinocytes. Burns.1

54、992;18:S11-S16.24 Tsao MC, Walthall BJ, Ham RG.Clonal growth of normal human epidermal keratinocytes in a defined medium.J Cell Physiol.1982;110(2):219-229.25 Zare S,Zarei MA,Ghadimi T,et al.Isolation, cultivation and transfection of human keratinocytes.Cell Biol Int. 2014;38(4):444-451.26 Pajoum Sh

55、ariati SR,Shokrgozar MA,Vossoughi M, et al.In vitro co-culture of human skin keratinocytes and fibroblasts on a biocompatible and biodegradable scaffold.Iran Biomed J.2009;13(3):169-177.27 Lam PK,Chan ES,To EW,et al.Development and evaluation of a new composite Laserskin graft.J Trauma.1999;47(5):918-922.28 Rheinwatd JG,GreenH.Seria cultivation of strains of human epidemal keratinocytes: the formation keratinizin colonies from single cell is.Cell.1975;6:331-343.29 汪培铭.不同细胞